真姬菇菌絲體發酵藜麥產物中多糖的抗氧化和α-淀粉酶抑制活性

李奕葶，王文振，趙嘉偉，孫寧，黃亮，楊紅澎，王玉，班立桐

（天津農學院 農學與資源環境學院，天津 300384）

真姬菇又名斑玉蕈，含有豐富的蛋白質、維生素、膳食纖維等營養物質及多糖、多酚、黃酮等天然活性產物，而且具有抗氧化、抗疲勞、調節血糖等諸多生理活性，是一種藥食兼用的食用菌[1]。食用菌多糖具有抗氧化、抗衰老、調節血脂、血糖、抑制炎癥、抑制腫瘤、抗輻射、增強免疫系統功能等活性[2-3]。食用菌多糖的生理活性與其分子量大小、空間構型及理化性質等相關，若其分子立體機構改變，活性將會喪失[4]。通過大量研究發現，具有三螺旋構型的真菌多糖具有最佳的生理活性[5]，而且分子質量小于10 kDa或大于200 kDa的真菌多糖一般沒有活性[6]。

藜麥是一種起源于南美洲的全能型谷物，各營養物質占干重的比例：蛋白質16%～22%、脂類1.8%～9.5%、總酚0.7%～0.9%、皂苷0.7%～3.1%，物質含量隨種類不同而變化[7]。目前，藜麥被開發成多種產品，藜麥啤酒、藜麥酸奶、藜麥功能性飲料等[8-10]。固體發酵是一種傳統的利用固體基質發酵的方式，可以使微生物維持原來的自然生長狀態，有利于發酵的各種代謝產物積累[11]。藜麥富含微生物可利用的各種營養成分，可以作為食用菌生長的固體培養基。有研究表明，用香菇菌絲體發酵藜麥后，發酵產物中多糖含量與未發酵時相比增加了31倍[12]。

由于真姬菇引入我國的時間較晚，目前大部分研究均集中在子實體栽培與營養分析方向，缺乏菌絲體發酵等相關研究。因此，本研究利用真姬菇菌絲體發酵藜麥，通過單因素試驗，探討不同條件對多糖提取量的影響，篩選較優方法提取發酵物多糖。對粗多糖進行分離純化，評價純化前后多糖的抗氧化和α-淀粉酶抑制活性。本研究為真姬菇菌絲體的應用提供了新的思路，為真姬菇與藜麥固體發酵產物作為功能性食品應用的可行性奠定了一定的理論與數據基礎，也為發酵產物中生理活性物質的利用提供了研究方向。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種與原料

真姬菇菌種HB-1：保藏于天津農學院食用菌研發中心；白色藜麥：市售。

1.2 試劑

氯仿（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；正丁醇（分析純）：天津市光復科技發展有限公司；纖維素酶（50 U/mg固體）：上海麥克林生化科技有限公司；2，2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽 [2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：東京化成工業株式會社；阿卡波糖片（每片含阿卡波糖50 mg）：拜耳醫藥保健有限公司；枯草芽孢桿菌α-淀粉酶（≥4 000 U/g固體）、豬胰腺α-淀粉酶（≥10 U/mg固體）：上海鼓臣生物技術有限公司。

1.3 儀器設備

電熱恒溫培養箱（DNP-9272BS-III）：上海新苗醫療器械制造有限公司；微波爐（G80F20CN2L-B8）：廣東格蘭仕集團有限公司；超聲波細胞粉碎機（JY88-II）：寧波新芝生物科技股份有限公司；旋轉蒸發器（RE-2000A）：上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機（Alpha1-2LDplus）：德國克萊斯特；臺式高速離心機（Centrifuge5430）：德國艾本德股份公司；酶標儀（Enspire）：美國珀金埃爾默儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 真姬菇發酵藜麥

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂粉、蒸餾水1 000 mL。

擴大培養：將真姬菇菌種轉接到斜面PDA培養基中，25℃培養10 d。待菌絲長滿斜面后，繼續轉接到平板PDA培養基中，25℃培養10 d。

種子液培養：在平板培養基中，選取5塊0.5 cm2大小的菌塊，轉接至錐形瓶液體培養基中（同PDA固體培養基，無瓊脂），25℃160 r/min條件下恒溫振蕩培養7 d。

固體發酵：藜麥挑揀后磨粉，過200目篩，稱取藜麥干粉25 g，倒入250 mL三角瓶中，配制成含水量約為80%的固體培養基，加入糊精（2.5 g/100 g干重）、酵母粉（0.5 g/100 g干重）、真姬菇菌絲體接種量為10 mL/100 g干重，25℃靜置培養20 d，得發酵產物。

發酵后處理：將發酵產物取出并于50℃烘干，磨粉后過200目篩，收集粉末放置于干燥箱中保存。

1.4.2 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[13]測定真姬菇與藜麥發酵產物中多糖的含量。取1 mL多糖樣品，0.5 mL 5%苯酚以及2.5 mL濃H2SO4，充分混勻、煮沸，20 min后將其取出，冷卻后于490 nm處測定吸光值。代入葡萄糖標準曲線方程，y=0.011 1x+0.006 3，決定系數r2=0.997，計算多糖濃度進一步換算出含量。

1.4.3 多糖提取單因素試驗

1.4.3.1 微波輔助提取法

精確稱取1 g發酵物粉末，加入20 mL蒸餾水，使用微波爐輔助提取，具體方法：1）分別采用微波功率70、210、350、490、700 W 對樣品進行處理，微波時間為100 s，微波后沸水浴2 h，測定多糖含量，篩選較優微波功率；2）在較優微波功率條件下，微波時間選取30、60、90、120、150、180 s，微波后沸水浴 2 h，測定多糖含量，并確定較優微波時間。

1.4.3.2 超聲波輔助提取法

精確稱取1 g發酵物粉末，加入20 mL蒸餾水，使用超聲波細胞破碎儀輔助提取，具體方法：1）分別采用超聲波功率 50、100、150、200、250 W 對樣品進行處理，超聲時間20 min，超聲后沸水浴2 h，測定多糖含量，篩選較優超聲功率；2）在較優超聲功率條件下，超聲時間選取 5、10、15、20、25 min，超聲后沸水浴 2 h，測定多糖含量，并確定較優超聲時間。

1.4.3.3 酶解輔助提取法

精確稱取1 g發酵物粉末，加入20 mL蒸餾水，使用纖維素酶輔助提取，具體方法：1）提取液中分別加入 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/100 mL 纖維素酶進行處理，作用時間為1 h，然后沸水浴2 h，測定多糖含量，篩選較優酶添加量；2）在較優酶添加量條件下，酶解時間選取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，酶解結束后沸水浴 2 h，測定多糖含量，篩選較優酶解時間。

1.4.4 發酵產物粗多糖的制備與分離純化

在單因素較優提取條件下，提取發酵物的多糖成分。將提取液離心并收集上清液，旋蒸后用4倍體積乙醇沉淀，放入4℃冰箱靜置12 h，再次離心，收集沉淀，待溶劑全部揮發后，以適當比例溶于蒸餾水，利用Sevage試劑（氯仿、正丁醇體積比為5∶1）去除提取物中的蛋白質成分，重復3次～5次[14]。用大孔樹脂AB-8去除色素[15]，濃縮與冷凍干燥后稱重，并采用下式計算多糖保留率。

使用DEAE-52纖維素離子交換柱純化提取的粗多糖，柱填料經過堿-酸-堿的前處理后，利用濕法裝柱（2.6 cm×50 cm），并避免氣泡產生[16]。利用蒸餾水、0.1、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液依次對層析柱洗脫。流速為1.0 mL/min，每管收集2 mL。利用苯酚硫酸法測定多糖含量。收集并標記好含有不同組分的多糖樣品，冷凍干燥后稱重，采用下式計算多糖得率。

1.4.5 抗氧化試驗

1.4.5.1 DPPH自由基清除能力

將純化前后的多糖以及陽性對照VC，配制成10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16 mg/mL 的不同濃度梯度的溶液。取125 μL多糖樣品溶液，加入500 μL DPPH乙醇溶液（25 μg/mL），混合均勻后，置于黑暗處反應30 min，并在517 nm波長下測得吸光度值為A1，用蒸餾水代替多糖樣品反應后的吸光值為A0，蒸餾水替DPPH乙醇溶液反應后的吸光值為A2[17]，采用下式計算DPPH自由基清除率。

1.4.5.2 ABTS+自由基清除能力

樣品及陽性對照溶液配制方法同1.4.5.1。取50 μL多糖樣品，加入450 μL ABTS溶液，混合均勻后反應10min，在734nm處測吸光值，記為A1，取蒸餾水0.9mL加入0.1 mL待測樣品，測734 nm處吸光值，記為A2，取ABTS溶液0.9 mL加入0.1 mL蒸餾水，測734 nm處吸光值，記為A0[18]，采用下式計算ABTS+自由基清除率。

1.4.5.3 羥基自由基（·OH）清除活性

樣品及陽性對照溶液配制方法同1.4.5.1。取9 mmol/L FeSO4與9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各1 mL，搖勻后加入1 mL多糖溶液、1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，37℃水浴反應1 h后，冷卻至20℃左右，在510 nm下測吸光值記為A1，用蒸餾水代替多糖樣品后的吸光值記為A0，蒸餾水替代水楊酸溶液反應后的吸光值記為A2[19]，采用下式計算羥基自由基清除率。

1.4.6 α-淀粉酶活性抑制試驗

采用碘-淀粉比色法分別測定陽性對照阿卡波糖、純化與未純化多糖對豬胰腺、枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶的抑制活性[20]。試驗在0.1 mol/L pH值為7.0的磷酸鉀緩沖液酶活力測定體系中進行。多糖溶液配制方法同1.4.5.1。在試管中加入0.05 mL不同濃度的多糖待測樣品以及1 mL 0.3 g/L的淀粉溶液，于37℃溫育5 min后加入0.05 mL 0.01 mg/mL α-淀粉酶。45℃反應3 min后，加入1 mL 0.01 mol/L碘液進行檢測，在660 nm處測定吸光值為A1，淀粉溶液與碘液反應后的吸光值記為A0，采用下式計算α-淀粉酶活性抑制率。

2 結果與分析

2.1 多糖提取單因素試驗

2.1.1 微波輔助提取法對多糖提取量的影響微波輔助對多糖提取量的影響見圖1。

圖1 微波輔助對多糖提取量的影響Fig.1 Effect of microwave-assisted on polysaccharide extraction

如圖1A所示，多糖提取量隨微波功率的增高而增長，在700 W微波輔助條件下，多糖提取量達到峰值，為（152.24±2.52）mg/g。如圖 1B 所示，隨著時間的推移，多糖的提取量先增大后減小，可能是由于微波時間過長導致多糖降解。在時間為120 s時，多糖提取量最高，為（157.13±1.13）mg/g。微波輔助法提取多糖較優功率為700 W，較優微波時間為120 s。

2.1.2 超聲輔助提取法對多糖提取量的影響

超聲波輔助對多糖提取量的影響見圖2。

圖2 超聲波輔助對多糖提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic assisted on polysaccharide extraction

如圖2A所示，隨著超聲功率的提高，多糖的提取量先增高后降低，超聲功率過高可能會引起多糖糖苷鍵斷裂，降解為小分子片段，從而降低提取率。在功率為150 W 時，提取量達峰值，為（163.52±3.29）mg/g。如圖2B所示，多糖的提取量隨超聲時間的增長而增多，在15 min～20 min時多糖含量有所下降，可能是由于超聲導致多糖降解率大于多糖溶出率。超聲時間為25 min 時，多糖提取量達峰值，為（170.73±2.28）mg/g。較優超聲功率為150 W，較優超聲時間為25 min。

2.1.3 纖維素酶輔助提取法對多糖提取量的影響

纖維素酶輔助提取法對多糖提取量的影響見圖3。

如圖3A所示，在酶添加量0.2%～0.4%時，多糖提取量略有下降；當添加量增加到0.4%～0.8%時，提取量隨著酶添加量增長而增高，在1.0%時降低，可能是由于過量的酶會抑制酶解的正常進行。當酶添加量為0.8%時，多糖提取量達到最高，為（196.77±2.93）mg/g。如圖3B所示，多糖提取量隨時間的增長先增高后降低，可能是由于隨著酶解時間的延長，降解產物對纖維素酶產生抑制作用導致的。在2.0 h時，多糖提取量達峰值，為（207.67±2.52）mg/g。纖維素酶較優添加量為0.8%，較優酶解時間為2.0 h。將3種輔助提取方法的提取結果進行比較，選取纖維素酶輔助法提取發酵產物多糖。

圖3 纖維素酶輔助對多糖提取量的影響Fig.3 Effect of cellulase on polysaccharide extraction

2.2 真姬菇發酵藜麥產物粗多糖的分離純化

提取的粗多糖用Sevage法除蛋白、AB-8大孔樹脂脫色后，多糖保留率僅為30.82%。將多糖進一步用DEAE-52纖維素離子交換柱純化，依次用蒸餾水、0.1、0.5、1.0 mol/L NaCl作為洗脫液，分離發酵產物的粗多糖成分。結果如圖4所示。

圖4 DEAE-52纖維素離子交換層析純化后多糖組分Fig.4 Polysaccharide components purified by DEAE-52 cellulose ion exchange chromatography

用蒸餾水洗脫時，在20管～75管出現峰值，收集洗脫液，為中性多糖（neutral polysaccharide，NP）組分。用0.1mol/LNaCl溶液洗脫，在95管～160管之間出現峰值，收集洗脫液，為酸性多糖-0.1（acid polysaccharide-0.1，AP-0.1）組分。用0.5mol/LNaCl溶液洗脫，在 185管～240管之間出現峰值，收集洗脫液，為酸性多糖-0.5（acid polysaccharide-0.5，AP-0.5）組分。用1.0 mol/L NaCl溶液洗脫，在245管～265管出現峰值，收集洗脫液，為酸性多糖-1（acid polysaccharide-1，AP-1）組分。將 4 個組分洗脫液分別進行旋蒸濃縮、冷凍干燥。稱量后，貼好標簽，放在干燥箱里保存。4個組分多糖得率：NP為30.67%，AP-0.1為10%，AP-0.5為22.67%，AP-1為36.67%。

2.3 抗氧化試驗

2.3.1 DPPH自由基清除試驗

多糖對DPPH自由基清除率見圖5。

如圖5所示，VC具有顯著的DPPH自由基清除能力，當VC濃度在0.16 mg/mL時，清除率就已達到81.48%。而 NP、AP-0.1、AP-0.5、AP-1以及未純化的多糖（unpurified polysaccharide，UP），在測試濃度范圍內對DPPH自由基的清除率均沒有超過30%。在多糖濃度為10 mg/mL時，UP對DPPH自由基清除率最高，達到了28.95%，可能是由于未純化多糖含有其他抗氧化成分對DPPH自由基具有清除作用，NP的DPPH自由基清除率為18.94%，AP-0.1為28.29%，AP-0.5為19.42%，AP-1為21.11%。總體來看，這5種多糖對DPPH自由基均具有較弱的清除作用。

圖5 多糖對DPPH自由基清除率Fig.5 Scavenging rate of DPPH free radical by polysaccharide

2.3.2 羥基自由基（·OH）清除試驗

多糖對·OH的清除率見圖6。

圖6 多糖對·OH清除率Fig.6 Scavenging rate of·OH by polysaccharide

如圖6所示，VC對·OH的清除效果非常顯著。5種組分多糖在濃度為0.16 mg/mL～1.25 mg/mL時，對·OH的清除率隨濃度增加逐漸增強，但增長緩慢；當濃度在2.5 mg/mL～10 mg/mL時，清除率迅速提升；當濃度達到 10 mg/mL 時，UP、NP、AP-0.1、AP-0.5、AP-1對·OH的清除率均達到最大值，分別為43.36%、37.89%、39.69%、37.92%以及30.91%?？傮w來看，5種多糖對·OH起到了一定的清除作用，UP組分表現最為顯著，表明未純化多糖中可能含有對·OH具有清除作用的其他活性成分。

2.3.3 ABTS+自由基清除試驗

多糖對ABTS+自由基清除率見圖7。

圖7 多糖對ABTS+自由基清除率Fig.7 Scavenging rate of ABTS+free radical by polysaccharide

如圖7所示，VC對ABTS+自由基具有較強的清除效果。NP、AP-0.1、AP-0.5、AP-1、UP 對 ABTS+自由基的清除率隨著濃度的升高而增強。當多糖濃度均為10 mg/mL 時，UP、NP、AP-0.1、AP-0.5、AP-1 對 ABTS+自由基的清除率分別是41.12%、51.22%、48.79%、35.34%以及47.18%。這5種組分多糖對ABTS+自由基均具有一定的清除效果，其中NP清除效果最佳，UP與AP-0.5的清除效果相對較差。說明，多糖的抗氧化活性與其理化性質等因素相關，發酵產物的中性多糖組分具有較好的ABTS+自由基清除能力。

2.4 α-淀粉酶抑制活性

2.4.1 多糖對枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶抑制活性

多糖對枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶抑制率見圖8。

如圖8所示，陽性對照阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制作用顯著，并且具有濃度依賴性，而5組多糖組分的抑制效果均低于陽性對照。NP、AP-0.1、AP-0.5、AP-1、UP對枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶均有一定的抑制作用，但是沒有明顯的波動。AP-0.1比其他組分多糖的抑制作用顯著，抑制率最高，達到了60.22%；其次是AP-0.5，最高抑制率為49.37%，而UP的抑制效果較差，最高抑制率為僅25.32%。AP-0.1與AP-0.5為酸性多糖組分，其對枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶抑制活性可能不僅與多糖的分子量、分子大小、空間構型等相關，而且可能與酸性多糖特有的糖醛酸結構密切相關。

圖8 多糖對枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶抑制率Fig.8 Inhibition rate of polysaccharide on Bacillus subtilis α-Amylase

2.4.2 多糖對豬胰腺來源α-淀粉酶抑制活性

多糖對豬胰腺來源α-淀粉酶抑制率見圖9。

如圖9所示，陽性對照阿卡波糖對豬胰腺來源α-淀粉酶的抑制作用顯著，并且具有濃度依賴性，而5組多糖組分的抑制效果均低于陽性對照。當多糖濃度為10 mg/mL時，5組多糖中AP-0.5對豬胰腺來源α-淀粉酶的抑制效果最佳，且抑制率達到了50.36%，其次是AP-0.1，最高抑制率為48.96%，其余組分抑制效果均較弱。AP-0.1與AP-0.5為酸性多糖組分，其對豬胰腺來源α-淀粉酶的抑制機制可能與對枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶抑制機制類似，與酸性多糖的糖醛酸結構等理化因素相關。

圖9 多糖對豬胰腺來源α-淀粉酶抑制率Fig.9 Inhibition rate of polysaccharide on porcine pancreas α-amylase

3 討論與結論

對比文獻[12]研究結果，在多糖濃度為10 mg/mL時，香菇菌絲體發酵藜麥產物中粗多糖對DPPH自由基清除率，為真姬菇菌絲體發酵藜麥產物各組分多糖的2倍左右，而兩種食用菌發酵藜麥產物中多糖對ABTS+自由基清除率卻基本相似。聶瑩等[21]研究結果顯示，真姬菇子實體多糖濃度為10 mg/mL時，對DPPH自由基清除率為28%，對·OH清除率為92%，而對ABTS+自由基清除率只有12%。真姬菇菌絲體發酵藜麥產物中多糖與真姬菇子實體多糖相比，·OH清除率較低，DPPH自由基清除率相近，而ABTS+自由基清除率則較高。與其他食用菌多糖活性相比較，杏鮑菇菇頭多糖濃度在5 mg/mL時對ABTS+自由基清除率為70.9%[22]，而此時真姬菇菌絲體發酵藜麥產物中多糖只有40%左右，清除能力遠低于杏鮑菇菇頭多糖。姬松茸胞外多糖具有非常顯著的α-淀粉酶抑制活性，濃度為1 mg/mL時，其抑制效果高達90%左右，明顯高于真姬菇菌絲體發酵藜麥產物中多糖[23]。

綜上所述，多糖提取較優條件：纖維素酶添加量為 0.8%，酶解時間為 2.0 h。對比 NP、AP-0.1、AP-0.5、AP-1、UP這 5種多糖的抗氧化試驗，UP對DPPH·、·OH清除效果較為顯著，清除率最高達28.95%與43.36%；NP對ABTS+自由基清除效果最佳，最高清除率為51.22%。AP-0.1和AP-0.5分別對枯草芽孢桿菌、豬胰腺來源的α-淀粉酶抑制效果最佳。本研究為真姬菇在固體發酵方向的應用提供了新的思路，為發酵產物中活性物質作為功能性食品添加劑提供了理論依據與數據基礎，也為其他食藥用真菌在固體發酵方向上的應用做了鋪墊。