響應面法優化自選乳酸菌發酵核桃乳飲料的工藝條件

李棟，宋佳寶，牟德華

（河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊 050018）

核桃仁富含油脂、蛋白質、糖類和維生素等多種營養成分，具有極高的開發利用價值。核桃仁加工制成的核桃乳色澤乳白、香味濃郁，是一種新型的營養飲料[1]。核桃仁對于預防動脈粥樣硬化等心血管疾病、美容、抗衰老等起著重要作用[2]。乳酸菌是一類能發酵糖產生乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱[3]，研究表明，乳酸菌及發酵產物能提高免疫力[4]，維持腸道菌群平衡[5]，降低膽固醇含量，并對胃病、糖尿病和心血管疾病等[6]有一定預防作用。乳酸菌能夠降解核桃乳中的蛋白質，使制品的風味更加醇厚。發酵核桃乳中含有對人體有益的乳酸菌，具有腸道保健功能[7-8]，豐富了市場上植物蛋白飲料的品種[9]。近年來，有關乳酸菌[10-12]發酵植物蛋白飲料的研究成為熱門，在現有發酵核桃乳[13-15]的研制工藝中，許多學者在發酵基料中加入了牛奶、乳清粉等動物蛋白以促進益生菌發酵[16]，或直接以脫脂核桃粕為原料[17-18]，對發酵過程中的工藝參數進行了探究，并對發酵核桃乳的營養價值進行了初步探究。本研究采用河北科技大學食品與生物學院飲料酒釀造研究室分離篩選出的乳酸菌（植物乳桿菌亞種KDLLL1-1和意大利腸球菌KDLLJ3-1）發酵核桃乳，以核桃乳飲料酸度為評價指標，研究乳酸菌發酵核桃乳飲料的最佳工藝條件，為發酵核桃乳飲料工業化生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 乳酸菌

植物乳桿菌亞種（Lactobacillus plantarum subsp.）KDLLL1-1、意大利腸球菌（Enterococcus italica）KDLLJ3-1：河北科技大學食品與生物學院飲料酒釀造研究室分別從羊羔美酒大曲和開菲爾粒中分離篩選得到，經過重復序列聚合酶鏈式反應技術和16S rDNA序列分析得到基因序列，在GeneBank數據庫中登陸，經BLAST相似性比對確定屬種，登錄號分別為KC454277和KJ890357。

核桃乳：河北綠嶺康維食品有限公司。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母提取物、瓊脂：北京奧博星生物技術有限公司；牛肉膏、MgSO4·7H2O：天津市光復精細化工研究所；葡萄糖：天津市科密歐化學試劑開發中心；CH3COONa·3H2O：天津市標準科技有限公司；K2HPO4·3H2O、H2MnO5S：天津市永大化學試劑廠；C6H8O7·3H3N：天津市百世化工有限公司；吐溫80：天津市凱通化學試劑有限公司；NaOH：天津市大陸化學試劑廠；酚酞：天津市大茂化學試劑廠。所有化學試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設備

DH300電熱恒溫培養箱、DK-98-11電子調溫萬用電爐：天津市泰斯特儀器有限公司；B1-220A麥克奧迪顯微鏡：Motic實業集團有限公司；PL203電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Delta320 pH計：深圳市凱銘杰儀器設備有限公司；SW-CJ-1FDA超凈工作臺：北京華威中儀科技有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋：河南省鞏義市英峪予華儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀、RID-10A紫外檢測器、LC-20ATA/B串聯泵：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 發酵核桃乳酸度的測定

采用酚酞指示劑法進行酸度測定，具體參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》。

1.2.2 發酵核桃乳飲料單因素試驗

1.2.2.1 碳源種類的選擇

以發酵核桃乳酸度為指標，將乳清粉、蔗糖分別按20 g/L的添加量加入到核桃乳中，按照植物乳桿菌亞種：意大利腸球菌=2∶1（菌懸液體積比），接種量9%，34℃發酵18 h。同時以不添加碳源（以水替代）作為對照，考察碳源種類對發酵核桃乳酸度的影響。

1.2.2.2 碳源添加量的選擇

以乳酸菌接種量9%，34℃發酵10 h，考察碳源添加量（5、10、20、30、40 g/L）對發酵核桃乳酸度的影響。

1.2.2.3 乳酸菌接種量的選擇

以碳源添加量20 g/L，34℃發酵10 h，考察乳酸菌接種量（5%、7%、9%、11%、13%）對發酵核桃乳酸度的影響。

1.2.2.4 發酵溫度的選擇

以乳酸菌接種量9%和碳源添加量20 g/L，發酵10 h，考察發酵溫度（28、31、34、37、40 ℃）對發酵核桃乳酸度的影響。

1.2.3 響應面法優化試驗

在單因素試驗的基礎上，以乳酸菌接種量、發酵溫度、碳源添加量為3個考察因素，發酵核桃乳酸度為考察指標，利用Design-Expertv8.0.6.1軟件進行Box-Behnken響應面分析和優化，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 The factor and level of response surface test

1.2.4 發酵核桃乳的感官評價

由10名經過訓練具有感官評定經驗的人員對發酵核桃乳進行感官評價，結果取平均值。發酵核桃乳感官評分標準見表2。

表2 發酵核桃乳感官評分標準Table 2 Sensory scoring standards for fermented walnut milk

1.3 數據處理

所有試驗均做3個平行，取平均值，利用Origin8.5軟件作圖，通過SPSS22.0統計軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 碳源種類對發酵核桃乳酸度的影響

碳源種類對發酵核桃乳酸度的影響結果見圖1。

圖1 碳源種類對發酵核桃乳酸度的影響Fig.1 The effect of carbon source types on the acid degree of fermented walnuts

由圖1可見，未添加碳源和添加蔗糖時發酵過程中乳酸菌產酸效果較差，相比之下，添加乳清粉時乳酸菌產酸效果明顯，乳清粉與蔗糖相比含有更多種營養物質，如蛋白質和一些小分子物質。從工業化生產角度考慮，乳清粉價格比較低廉，所以最終選取乳清粉為碳源。

2.1.2 碳源添加量對發酵核桃乳酸度的影響

碳源添加量對發酵核桃乳酸度的影響結果見圖2。

圖2 不同碳源添加量對發酵核桃乳酸度的影響Fig.2 The effect of different carbon sources addition on the acid degree of fermented walnuts

如圖2所示，碳源添加量在5 g/L～40 g/L范圍內，發酵核桃乳酸度隨著碳源添加量的增加先上升后下降，其原因可能是由于碳源添加量過大時抑制了乳酸菌的生長，導致發酵過程受到了影響，發酵核桃乳酸度下降，最佳碳源添加量為30 g/L。

2.1.3 乳酸菌接種量對發酵核桃乳酸度的影響

乳酸菌接種量對發酵核桃乳酸度的影響結果見圖3。

圖3 乳酸菌接種量對發酵核桃乳酸度的影響Fig.3 Effect of lactic acid bacteria inoculation amount on the acid degree of fermented walnuts

如圖3所示，當乳酸菌接種量低于11%時，隨乳酸菌接種量的提高，發酵核桃乳酸度逐漸增大。當乳酸菌接種量高于11%時，菌種發酵產酸的效果變差，發酵核桃乳中酸含量下降，可能的原因是乳酸菌接種量過大，導致乳酸菌大量生長繁殖，不利于發酵，從而導致最終酸度有所降低。綜上，發酵核桃乳的最佳乳酸菌接種量為11%。

2.1.4 發酵溫度對發酵核桃乳酸度的影響

發酵溫度對發酵核桃乳酸度的影響結果見圖4。

圖4 發酵溫度對發酵核桃乳酸度的影響Fig.4 The influence of fermentation temperature on the acid degree of fermented walnuts

發酵溫度對乳酸菌發酵核桃乳起到關鍵性作用。如圖4所示，在37℃以下，隨發酵溫度升高發酵核桃乳酸度增大，當發酵溫度超過37℃時，發酵核桃乳酸度會隨發酵溫度升高而降低，因此最適宜的發酵溫度為37℃。

2.2 響應面試驗法優化核桃乳發酵工藝條件

發酵條件優化響應面設計方案及結果見表3，方差分析見表4。

表3 發酵條件優化Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Box-Behnken test design and results of optimization of fermentation conditions

表4 以酸度為響應值的回歸模型及方差分析Table 4 Regression model and analysis of variance with acidity as the response value

采用Design-Expert v8.0.6.1統計軟件對表4結果進行多元回歸擬合分析，建立二次回歸方程：Y=36.87-0.18A+0.27B+0.42C-0.20AB+0.45AC+0.0001BC-1.29A2-1.23B2-2.90C2。

由表 4 可知，該模型 P＜0.05；失擬誤差 P＞0.05，即回歸模型顯著而失擬項不顯著，說明發酵核桃乳酸度與各因素的回歸模型有統計學意義。方程的決定系數R2=0.851 3，擬合度良好，方程的顯著性及可靠性較高。根據F值大小可知，各因素對發酵核桃乳酸度影響的主次因素為C＞B＞A，即碳源添加量＞發酵溫度＞乳酸菌接種量。

通過軟件進行分析得出最佳工藝條件為乳酸菌接種量10.86%，發酵溫度37.34℃，碳源添加量30.7 g/L。在此條件下，發酵核桃乳酸度預測值為36.91°T?？紤]到試驗的可操作性，修正最佳工藝條件為乳酸菌接種量11%，發酵溫度37℃，碳源添加量30 g/L。在此條件下，自選乳酸菌發酵核桃乳飲料酸度達到36.53°T，與預測值接近。說明模型擬合性良好，驗證了模型的有效性。

2.3 發酵核桃乳飲料感官評價

發酵核桃乳飲料的感官評價結果見表5。

由表5可知，發酵后的核桃乳，色澤呈現乳白色和淡黃色，氣味較未發酵之前有明顯的核桃乳發酵香氣，口感細膩、酸甜適度，可被大部分感官評價者所接受。經最佳工藝處理后，發酵核桃乳飲料的組織形態均勻、無分層，感官評分為84。

表5 發酵核桃乳的感官評價Table 5 Sensory evaluation of fermented walnut milk

3 結論

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken中心組合設計，通過響應面分析確定自選乳酸菌發酵核桃乳最佳工藝條件：碳源選擇乳清粉，添加量為30 g/L，自選植物乳桿菌亞種 KDLLL1-1和意大利腸球菌KDLLJ3-1按照2∶1體積比，接種量為11%，37℃發酵10 h，所得發酵核桃乳飲料酸度為36.53°T，乳白色，細膩、均勻，核桃乳發酵香氣獨特，酸甜適度。