富黃酮洋蔥啤酒發酵工藝的優化

程飛宇，馬立娟，李弘軒，朱振昊，張孟灝，韓帥峰，范佳鈺，韓蓓

（天津科技大學 生物工程學院，天津 300457）

洋蔥是一種常見的廉價家常菜，其肉質柔嫩，汁多辣味淡，品質佳，適于生食。在國外它被譽為“菜中皇后”[1]，營養價值較高。洋蔥中含有豐富的黃酮類化合物及花青素，具有抗炎、抗氧化、降血壓、降血脂、抑制腫瘤等生理作用[2]。洋蔥不僅作為一種調味品，更是膳食中營養和功能成分的重要來源。近年來，隨著人們保健意識的增強，日益強調食品原料及添加劑的天然性、功能性，因此人們更加關注洋蔥的功能特性。洋蔥大多被用來直接食用，除此之外，隨著人們對洋蔥的功能活性的深入了解和重視，洋蔥的粗加工和深加工產品也越來越多。洋蔥的粗加工產品主要有脫水洋蔥片、洋蔥醬等；深加工產品有從洋蔥中提取出的黃酮、精油等[3-5]；發酵產品有洋蔥醋、洋蔥酒等。例如，于亞敏[6]對洋蔥葡萄酒進行了開發，建立了發酵型洋蔥葡萄酒的生產工藝；江成英等[7]研究了發酵生產洋蔥糯米酒的主要工藝參數。隨著對洋蔥深加工的深入研究，越來越多的洋蔥發酵產品將被研制并生產。

本研究將新鮮紫皮洋蔥中的功能性物質黃酮的提取液添加到制備好的麥芽汁中進行啤酒發酵，充分利用洋蔥中的功能活性成分，開發一種口味獨特、營養健康的富黃酮洋蔥啤酒。通過考察pH值、富黃酮提取液添加量和酵母接種量等因素對洋蔥啤酒中酒精度和黃酮增長率的影響，采用Box-Behnken響應面法優化啤酒的發酵工藝，為富黃酮洋蔥啤酒的開發提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洋蔥（新鮮紫皮洋蔥）、蘋果（冰糖心蘋果）：市售；麥芽、酒花（卡斯卡特酒花，α-乙酸含量4.5%～7.0%）、啤酒酵母（Weiss）：帝伯仕啤酒技術有限公司；蘆丁標準品（純度99%）：北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（酶活4萬U/g）：諾維信（中國）生物技術有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）：南京試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

754型紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；MJ-LZ25Easy121多功能三杯榨汁機研磨機：佛山佳頓電器有限公司；DK-S82型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；SY-100E型多用途恒溫超聲提取儀：北京宏祥隆生物技術開發有限公司；DHG-9016A型電熱恒溫鼓風干燥箱：太倉精宏儀器設備有限公司；AR2140型電子分析天平：奧豪斯國際商貿（上海）有限公司；SPX250B-Z型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；EXPEC 5230氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀：杭州譜育科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麥芽汁的制備

將干燥的麥芽進行粉碎后放入鍋中，隨后以液料比3∶1（mL/g）向鍋中加入適量的水攪拌，充分混勻。將其放置于水浴鍋中，于52℃下加熱30 min，隨后升溫至65℃保持70 min，接下來在72℃和78℃各保持10 min進行糖化，結束后過濾。將濾液煮沸并在初沸10、40 min和結束前10 min 3個時間段分別加入20%、40%、40%的酒花，然后降溫過濾、離心除去雜質，最終獲得澄清透明的麥芽汁。

1.3.2 富黃酮提取液的制備

將新鮮的紫皮洋蔥先用自來水洗凈，再用蒸餾水清洗晾干后，放入榨汁機進行粉碎。將粉碎后的洋蔥汁渣倒入錐形瓶中，并向錐形瓶中添加0.5 mg/g的纖維素酶，混勻后在pH4.5、40℃條件下酶解150 min。將酶解后的洋蔥汁渣進行超聲處理30 min[8，11-13]，進行離心后得到富黃酮提取液。

1.3.3 富黃酮洋蔥啤酒的制備工藝流程

富黃酮洋蔥啤酒的制備工藝流程見圖1。

圖1 富黃酮洋蔥啤酒的制備工藝流程Fig.1 Processing flow of flavonoid-rich onion beer

1.3.4 黃酮含量測定

標準曲線的繪制：精確配制0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液，將不同體積的該標準溶液置于10 mL試管中，分別加入一定體積的5%的亞硝酸鈉溶液、1%的硝酸鋁溶液和4%的氫氧化鈉溶液，放置15 min，在510 nm條件下測量吸光度。以蘆丁的濃度c（mg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸分析，得到標準曲線的回歸方程為A=0.011 7c+0.011 9，R2=0.997 5。

黃酮含量的計算：通過分光光度計測量發酵前和發酵后的富黃酮洋蔥啤酒在510 nm條件下的吸光度，再根據之前得到的蘆丁標準曲線方程，代入求出不同樣品所對應的黃酮濃度，進而確定樣品中黃酮的含量。

黃酮增長率的計算：根據得到的發酵前后洋蔥啤酒的黃酮含量來計算不同發酵條件下的黃酮增長率，公式如下。

式中：R為黃酮增長率，%；M2為啤酒發酵后的黃酮含量，μg/mL；M1為啤酒發酵前黃酮的含量，μg/mL。

1.3.5 酒精度的測定

按照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》，乙醇體積分數采用酒精計法測定。

1.3.6 啤酒中風味物質的測量

通過氣相色譜儀測定啤酒的風味物質（高級醇類和酯類）的含量[14-15]。

1.3.7 啤酒發酵單因素試驗

固定發酵時間為7 d，分別探究洋蔥啤酒發酵過程中 pH 值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、富黃酮提取液添加量（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、酵母接種量（100、120、130、140、160 μL/100 mL）對富黃酮洋蔥啤酒酒精度和黃酮增長率的影響。

1.3.8 響應面優化

對試驗優選的因素采用響應面優化分析法，通過Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken design（BBD）試驗設計[16-20]。

1.4 數據處理

單因素和響應面試驗數據采用Design-Expert 8.0.6軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

單因素試驗結果顯示，當pH值為5.0～6.0，富黃酮提取液添加量為0.5%～2.0%，酵母接種量為120μL/100 mL～160 μL/100 mL時，樣品的酒精度較佳，黃酮增長率在此范圍內有最大值。因此，以最適發酵時間7 d為基礎，采用響應面法對單因素試驗結果進一步優化以確定最佳發酵條件。

2.2 響應面試驗設計與結果

2.2.1 BBD試驗設計及結果

采用Design-Expert8.0.6軟件進行BBD試驗方案設計與結果分析，結果如表1所示。以發酵液的酒精度和黃酮增長率為因變量進行雙值響應面分析，結果見表2。

表1 BBD因素及水平Table 1 Factors and levels of BBD

表2 BBD方案及響應值Table 2 Scheme and response value of BBD

對得到的結果進行擬合，分別得到酒精度（Y1）和黃酮增長率（Y2）與富黃酮提取液添加量、pH值、酵母接種量之間的二次多項回歸方程：Y1（酒精度）=4.53-0.60A-0.33B-0.059C+0.087AB-0.25AC+7.500×10-3BC+0.39A2-0.71B2+0.55C2；Y2（黃酮增長率）=40.16-0.59A-3.97B+4.25C-1.56AB-0.64AC+1.95BC-2.82A2-2.26B2-9.34C2。

對得到的試驗數據進行方差分析，結果見表3。

表3 BBD試驗中酒精度和黃酮增長率二次回歸方差分析結果Table 3 Results of quadratic regression analysis of variance of alcohol content and flavonoid growth rate in BBD test

由表3可知，酒精度的回歸模型顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05）；黃酮增長率的回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該回歸模型與實際情況比較吻合，可用于洋蔥啤酒的制備工藝分析和預測。在回歸模型中，A、B2對于酒精度的影響極顯著，B、C2對于酒精度影響顯著；B、C、C2對于黃酮增長率的影響極顯著，在所設計的試驗范圍內各因素對酒精度的影響順序為富黃酮提取液添加量＞pH值＞酵母接種量，對黃酮增長率的影響順序為酵母接種量＞pH值＞富黃酮提取液添加量。

2.2.2 交互項對酒精度和黃酮增長率影響

圖2為洋蔥啤酒發酵過程中pH值、富黃酮提取液添加量和酵母接種量這3個因素兩兩之間的交互作用對啤酒的酒精度和黃酮增長率的影響的三維響應圖。

圖2 交互作用對富黃酮洋蔥啤酒中的酒精度和黃酮增長率的影響Fig.2 Effect of interaction on alcohol content and growth rate of flavonoids in flavonoid-rich onion beer

根據圖2分析可得知，當富黃酮提取液添加量（A）、pH值（B）和酵母接種量（C）兩兩相互作用時，AC和BC的等高線的橢圓度較大，3D曲面的坡度較陡，說明AC和BC的交互作用對黃酮增長率的影響顯著，其中富黃酮提取液添加量（A）和酵母接種量（C）的交互作用對黃酮增長率的影響最大，這與回歸模型方差分析的結果一致。

2.2.3 最優條件與驗證

根據軟件分析可知，獲得最大黃酮增長率的優化條件為富黃酮提取液添加量1.338%，pH5.07，酵母接種量142.68 μL/100 mL，在該條件下預測得到黃酮增長率為42.11%，酒精度為4.20%vol；獲得最佳酒精度的優化條件為富黃酮提取液添加量1.316%，pH5.83，酵母接種量157.49 μL/100 mL，在該條件下預測得到黃酮增長率為33.99%，酒精度為4.30%vol。綜合考慮，確定最佳發酵條件為富黃酮提取液添加量1.338%，pH5.07，酵母接種量 142.68 μL/100 mL，考慮實際工藝條件，調整最優發酵工藝條件為富黃酮提取液添加量1.3%，pH5.1，酵母接種量 143 μL/100 mL，根據所選取的各個參數進行驗證試驗。結果表明，在此條件下所得到的富黃酮洋蔥啤酒的黃酮增長率為41.9%，酒精度為4.30%vol，與預測值相對誤差在1%以內，實際值與預測值擬合較為良好，具有實際參考價值。

3 結論

本文以開發洋蔥深加工產品為目標，將紫皮洋蔥中的功能性物質黃酮應用于啤酒發酵，對富黃酮洋蔥啤酒的釀造工藝運用單因素試驗初步確定最適條件，然后利用響應面法，以酒精度和黃酮增長率為響應值，對洋蔥啤酒發酵過程中的酵母接種量、pH值、富黃酮提取液添加量進一步進行優化，分別建立待優化變量與響應值之間的回歸模型，通過模型檢驗與顯著性分析，確定最佳發酵條件，并進行試驗驗證。優化結果表明富黃酮洋蔥啤酒的最佳發酵條件：100 mL麥芽汁中，富黃酮提取液添加量為1.3 mL，pH值為5.1，酵母接種量為143 μL。在此條件下，最終產品的酒精度為4.30%vol，黃酮增長率為41.9%。得到的洋蔥啤酒中黃酮含量較高，清澈透明，顏色偏紅，口感醇正。