分子蒸餾結合尿素包合法富集羅漢菜籽油中神經酸

李俊雯，朱明明，吳夢琪，周旭東，張文清

（華東理工大學 化學與分子工程學院，上海 200237）

羅漢菜（Thlaspi arvense L.）為十字花科遏藍菜屬植物，學名菥蓂，別名遏藍菜、敗醬草、苦芥子、瓜子草等，分布廣泛，因其蓮座葉生長像疊羅漢而得名。羅漢菜全株和種子均可藥用，全株具有清肝明目、和中解毒的功能，用于治療目赤腫痛、消化不良、脘腹疼痛等病癥，其種子還可治風濕性關節炎、腰痛、急性結膜炎、胃痛等病癥[1]。研究表明，羅漢菜籽中富含亞油酸、亞麻酸、神經酸等脂肪酸，其中神經酸對中樞系統疾病、腦血管疾病都有積極作用[2]。但神經酸無法通過人體自身產生，需從外界攝取獲得[3]。由于羅漢菜籽油中含有豐富的神經酸，可達到3.66%左右，因此可作為神經酸開發的原料[4]。

目前常見的分離混合脂肪酸的方法有，尿素包合法[5-6]，超臨界 CO2萃取技術[7]，低溫結晶法[8]、分子蒸餾法[9-10]等。尿素分子在結晶過程中能與直鏈脂肪酸分子形成六面體結晶體，飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸易于形成尿素包合物；高不飽和脂肪酸因不飽和度高，空間結構更復雜，不易形成尿素包合物。尿素包合法具有操作簡便，試劑可回收等優點，被廣泛應用于混合脂肪酸分離。分子蒸餾又叫短程蒸餾，是一種特殊的液-液分離技術，極高真空度下，依據混合物分子運動的平均自由程差別，在遠低于其沸點的溫度下將其分離。與普通真空蒸餾相比，分子蒸餾能避免熱分解，精準精餾，減少了重要成分的損失。尿素包合法與分子蒸餾法聯用被越來越多地應用于混合脂肪酸的純化[11-12]。

本研究以羅漢菜籽為研究對象，以有機溶劑提取法提取油脂，皂化后得到混合脂肪酸。通過對分子蒸餾溫度的單因素探究，確定最佳的分子蒸餾工藝。在此基礎上，用正交試驗探究尿素包合法的主要因素（尿脂比、料液比、包合溫度）對神經酸含量和回收率的影響，分析分子蒸餾與尿素包合法聯用對混合脂肪酸中神經酸富集的影響。研究旨在為神經酸生產利用提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅漢菜籽：上海市嘉定區農業技術推廣服務中心，除雜、浮選去除品質較差的菜籽，干燥后粉碎，過40目篩，放入干燥器內備用；甲醇（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司；尿素、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、乙酸乙酯、正庚烷（均為分析純）、甲醇（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；硫酸（優級純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發儀（R213B）：上海申生科技有限公司；油浴鍋（DF-101S）：上海豫康科教儀器設備有限公司；冷凍干燥機（Scient2-10N）：寧波新芝生物科技股份公司；分析天平（ME104）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超純水儀（Master-15）：上海和泰儀器有限公司；氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS，6890N-5975）：美國安捷倫有限公司；分子蒸餾裝置（VKL70-5）：德國VTA公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸提取

以石油醚（60℃～90℃）為提取溶劑，將50 g羅漢菜籽加入到 400 mL 石油醚中[料液比為 1∶8（g/mL）]，加熱回流75 min，提取2次，過濾后將溶劑回收（110℃常壓蒸餾），得到油脂，出油率[13]按式（1）計算。

式中：m為混合脂肪酸質量，g；M為羅漢菜籽油脂質量，g。

1.3.2 脂肪酸組分分析

1.3.2.1 GC-MS條件

GC條件：HP-5MS型毛細管柱；載氣為高純氦氣（99.999%），柱前壓119.4kPa，柱內載氣流量0.5mL/min；升溫程序：從180℃開始，以3℃/min升溫到280℃，汽化室溫度為250℃；樣品進樣量為1μL；分流比為50∶1。

MS條件：采用EI離子源，離子源溫度230℃，接口溫度270℃，溶劑延時3 min，電子能量70 eV，掃描范圍 30 amu～550 amu，分辨率 1 000。

1.3.2.2 配制樣品溶液

在2 g油樣中加入10 mL 2.5 mol/L的CH3ONa溶液，磁力攪拌并80℃加熱回流至溶液澄清透明，再加入15 mL 0.5 mol/L的H2SO4甲醇溶液煮沸10 min。樣品冷卻后加入25 mL蒸餾水混勻，采用少量多次的方式，每次加入20 mL正庚烷萃取后得到正庚烷的脂肪酸甲酯溶液。最后去離子水洗滌樣品至洗滌液呈中性，用無水硫酸鈉干燥，濾液旋蒸濃縮后得到混合脂肪酸甲酯溶液，稀釋100倍得供試液。

1.3.2.3 神經酸含量測定

標準曲線的繪制：精密稱取0.102 3 g神經酸標準品，以甲醇為溶劑，配制濃度約為4 mg/mL的神經酸標準溶液。分別準確移取 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 神經酸

式中：γ為出油率，%；m為提取油質量，g；M為投入原料質量，g。

取100 g油脂于1 000 mL燒杯中，加入0.5 mol/L NaOH乙醇溶液800 mL，緩慢升溫至80℃，水浴攪拌1 h。待溫度降至室溫（25℃）后加入適量蒸餾水至溶液澄清，加入20%鹽酸調節pH值至2～3，轉入分液漏斗，加入乙酸乙酯，充分振蕩，靜置分層，保留乙酸乙酯層。將乙酸乙酯層加水洗至中性，去除水層，再加入適量無水硫酸鈉脫水，45℃旋蒸，回收乙酸乙酯，得到混合脂肪酸液，稱重計算混合脂肪酸得率。標準溶液，進行甲酯化處理，0.45 μm有機濾膜過濾后再進行氣相色譜檢測。以神經酸質量（m）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸分析，繪制神經酸標準曲線。

1.3.3 分子蒸餾法最適溫度的確定

稱量250 g混合脂肪酸，在刮膜速度300 r/min、進料速度5%、蒸餾壓力0.01 kPa、冷凝溫度40℃的條件下，考察蒸餾溫度從110℃～160℃對神經酸含量和重組分得率的影響。選擇的兩個溫度作為一級蒸餾和二級蒸餾的蒸餾溫度并收集二級蒸餾產物。

1.3.4 尿素包合法純化神經酸的條件優化

稱取分子蒸餾后所得混合脂肪酸1 g于三口燒瓶中，加入20 mL甲醇，并加入4 g尿素，80℃加熱回流至尿素溶解。待溶液澄清透明后停止回流，冷卻到室溫（25℃）。采用正交試驗的設置條件，混合脂肪酸在-20℃下包合12 h，從冷凍層取出，迅速抽濾，用少量蒸餾水溶解濾餅，加入20%鹽酸調節pH值至2～3，通過石油醚少量多次萃取，并水洗石油醚層至中性，最后無水硫酸鈉干燥后過濾，濾液旋蒸濃縮后得富集脂肪酸。以神經酸含量和回收率為指標探究尿脂比、料液比及包合溫度對尿素包合法的影響，并驗證其重復性。神經酸回收率按式（3）計算。

式中：m1為包合后混合脂肪酸中神經酸質量，g；m2為包合前混合脂肪酸中神經酸質量，g。

1.4 數據處理

每個試驗重復3次，結果表示為平均值±標準差。采用GraphPad Prism 6.01軟件進行作圖，采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸組分分析

氣相色譜分析得到神經酸標準品甲酯的保留時間為26.23 min，神經酸標準曲線的回歸方程為A=57.476m+7.239 9，相關系數R2=0.999 6，表明建立的神經酸含量標準曲線在2.046 mg～32.768 mg線性關系良好。

按1.3.1條件提取油脂，根據公式（1）計算出油率為22.38%，皂化后得到混合脂肪酸，根據公式（2）計算混合脂肪酸的得率為85.90%。羅漢菜籽油中的脂肪酸組成測定總離子流圖如圖1，各個脂肪酸的含量總結如表1。

圖1 羅漢菜籽油脂肪酸甲酯總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatograms（TIC）of solvent extracted Thlaspi arvense Linn seed oils fatty acid methyl esters

表1 羅漢菜籽油中脂肪酸的種類及含量Table 1 The Composition and content of solvent extracted Thlaspi arvense Linn seeds oil fatty acids

由表1可知，羅漢菜籽油中主要有6種脂肪酸，含量最高的為芥酸，其次為亞麻酸和亞油酸，神經酸的含量達到6.40%。而神經酸在元寶楓油中含量為5.52%，在其余草本植物種籽油中含量＜3%[14-15]。羅漢菜籽油原料的神經酸含量還略高于已經市場化的元寶楓油原料，故將以此法所得的混合脂肪酸作為后續分子蒸餾-尿素包合法聯用的原料。

2.2 分子蒸餾法純化神經酸

按1.3.3中的條件，探究不同的蒸餾溫度對神經酸含量和重組分得率的影響，結果如圖2所示。

圖2 不同溫度下一級分子蒸餾對神經酸含量和重組分得率的影響Fig.2 Effects of first level molecular distillation at different temperature on content of nervonic acid and yield of heavy component

由圖2可知，在110℃時分子蒸餾沒有進行，原料全部進入了重組分，并沒有達到分離的效果。110℃～140℃時神經酸含量隨著溫度的升高而升高，當140℃～160℃時隨著溫度的增加而下降，在140℃時神經酸含量達到最大值14.18%，而重組分得率一直隨著溫度的增加而減少，在120℃～130℃和150℃～160℃時迅速下降。綜合神經酸含量和重組分得率考慮，140℃時兩者都較高，為最佳的蒸餾條件，可以作為一級分子蒸餾的溫度；而150℃與160℃相比，雖然神經酸含量的差距不大，但是重組分得率在160℃有較大下降，故選用150℃作為二級蒸餾條件。綜上所述，選用140℃和150℃作為一級分子蒸餾和二級分子蒸餾的溫度，進行二次分子蒸餾對神經酸進行富集。

二次蒸餾后混合脂肪酸GC-MS總離子流圖如圖3所示，結果如表2所示。

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圖3 二次分子蒸餾前后脂肪酸甲酯總離子流色譜圖對比Fig.3 The comparison of TIC of methyl esters of fatty acids by two-levels molecular distillation

表2 分子蒸餾后的脂肪酸種類和含量Table 2 The composition and content of fatty acids molecular distillation

對比表1和表2可知，經過二次分子蒸餾后，重組分中相對分子質量相對較小的組分大幅度減少，棕櫚酸含量降低至0.06%；神經酸含量大幅度提高，從6.40%提高到了20.77%。

2.3 尿素包合法最佳工藝

以二次分子蒸餾的重組分作為尿素包合法的原料，探究尿脂比、料液比和包合溫度三者的影響，進行正交試驗。參考文獻[11-13]中相關條件，根據正交試驗設計表L9（33），正交試驗因素水平設計如表3。以純化后的神經酸含量為考察指標，探究最優試驗方案，結果如表4所示。

表3 正交試驗的因素水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

極差R的大小反映各因素對指標的影響程度，由表4可知，對于神經酸含量和回收率而言，極差均為RA＞RC＞RB，表明尿脂比對二者影響最大，其次是包合溫度，料液比對二者的影響相對較小。在方案A3B3C2下，其回收率為70.66%，神經酸的含量為26.10%；而在方案A1B2C2下，回收率達96.45%，神經酸的含量為21.00%。方案A1B2C2雖然回收率很高，但是相比于原料中神經酸含量的20.77%，該工藝對神經酸幾乎沒有富集效果。方案A3B3C2的回收率雖然略低于方案A1B2C2，但神經酸含量提升較大，綜合二者考慮，選擇最佳條件為尿脂比 1.25∶1，料液比 1∶12（g/mL），包合溫度-10 ℃。在最優方案的條件下平行做了3次驗證試驗，結果見表5。

表4 正交試驗結果Table 4 The Results of orthogonal experiment

表5 驗證試驗結果Table 5 The Results of verification experiment

由表5可知，神經酸含量可達26.23%，回收率可達70.82%，結果說明通過尿素包合法可以對分子蒸餾后混合脂肪酸中的神經酸進一步富集。

3 結論

本文采用有機溶劑法從羅漢菜籽中提取粗油，出油率為22.38%，采用分子蒸餾-尿素包合聯用的方法富集神經酸。分子蒸餾試驗中考察了蒸餾溫度對分離效果的影響，尿素包合試驗中探究了尿脂比、料液比和包合溫度對分離效果的影響。分子蒸餾能去除與神經酸相對分子質量差異較大的物質，而尿素包合法能去除飽和脂肪酸和一些低不飽和度的脂肪酸，兩者結合能使原料中的各類物質更好地分離。通過分子蒸餾結合尿素包合法也將神經酸含量從6.40%提高至26.23%。本研究為羅漢菜的油脂工藝開發提供了可靠的技術支持，為提高羅漢菜的綜合利用率提供了新思路。