黑菊芋多糖的提取工藝優化及其體外益生活性的研究

姬妍茹，楊慶麗，張正海，董艷，石杰，高寶昌，田媛，李國巍

（黑龍江省科學院 大慶分院，黑龍江 大慶 163319）

菊芋（jerusalem anichoke）俗稱洋姜，菊科向日葵屬草本植物。菊芋含有豐富的營養物質，如多糖、蛋白質、維生素、膳食纖維和硒等，具有較高的營養價值和多種生理功能[1]。鮮菊芋多糖（菊糖）是菊芋的主要功效成分，占其干重的70%以上，具有雙向調控血糖、改善腸道、防治便秘、促進礦物質吸收、預防肥胖、降血脂、抗腫瘤和提高免疫力等生理功能[2]。菊芋多糖由果聚糖組成，是已被科學論證過的符合益生元定義的不易被人體消化的多糖[3-4]。菊糖在人體的上消化道中不會發生消化分解，部分菊糖在結腸中可被益生菌發酵產生很少的熱量[5-7]和短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）[8]，能夠發揮改善腸道微環境，有效預防便秘等多種生理功效[9]。菊芋塊莖不耐貯存，通常直接炒食或者腌制成醬菜，口感脆硬，基本無甜味；黑菊芋是以鮮菊芋為原料，利用獨特的齒變加熱工藝加工而成的一種類似果脯的新型功能食品。前期研究發現，菊芋加工成黑菊芋后，糖類的構成和含量顯著改變，總糖含量有所降低，果聚糖分解為果糖、葡萄糖、蔗糖和低聚果糖等小分子糖類，還原糖含量顯著增加，占總糖含量的40%以上，是加工前的幾十倍，因而黑菊芋呈現香甜的口感[10]。

菊糖的制備流程一般分為預處理、提取和純化三步。預處理主要包括熱燙滅酶和干制，提取方法主要包括熱水浸提法、微波輔助法、超聲輔助法和酶解法，純化方法主要有鹽析法、石灰沉淀法、溶劑萃取法、透析法、離子交換法、色譜法以及酶解法等[11]。鮮菊芋經高溫加工成黑菊芋，其中的多酚氧化酶被滅活，多糖組成發生較大改變。因此，在提取黑菊芋多糖時，可以取消熱燙滅酶的預處理步驟。本研究采用超聲波輔助法提取黑菊芋多糖，并通過正交試驗進行工藝優化，通過傅立葉紅外光譜（Fourier transform infra red，FT-IR）對得到的多糖組分進行表征，并對多糖的益生活性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑菊芋：以紅果菊芋為原料，利用黑龍江省科學院大慶分院自制設備加工而成；果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖（均為色譜純）：北京中科儀友化工研究院；植物乳桿菌菌株ZL9、干酪乳桿菌菌株GL6：黑龍江省科學院微生物所；無水乙醇、苯酚、硫酸、3，5-二硝基水楊酸（均為國產分析純）：上海國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40SCI）：上海申安醫療儀器廠；高速離心機（GT10-1）：北京時代北利離心機有限公司冷凍干燥機（VFD-4500）：北京博醫康實驗儀器有限公司；超聲波清洗儀（KQ3200）：昆山市超聲儀器有限公司；高效液相色譜（LC-15C）：日本島津公司；酶標儀（Epoch）：美國 BioTek公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑菊芋多糖的提取

稱取10.0 g黑菊芋，切成1.5 cm左右的薄片，用50mL的蒸餾水80℃恒溫浸提16h，勻漿，然后以150W功率按照一定的超聲溫度、超聲時間和料液比進行提取，六層紗布過濾，4 000 r/min離心10 min，取上清，即為黑菊芋粗多糖溶液。

1.3.2 黑菊芋多糖提取工藝優化

分別以超聲溫度、超聲時間和料液比為影響因子進行單因素試驗。各因子設5個水平，超聲溫度設為 60、70、80、90、100 ℃，超聲時間設為 40、50、60、70、80 min，料液比設為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），每組試驗設3個平行。提取液離心取上清液，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[12]，計算多糖得率，確定單因素最佳條件。在此基礎上進行正交試驗，確定黑菊芋多糖的最佳提取工藝，多糖得率計算公式如下。

1.3.3 黑菊芋多糖的純化

向黑菊芋粗多糖溶液中加入氯仿-正丁醇（體積比4∶1）混合液多次萃取除去蛋白，直至兩相間無乳白色絮狀物。濃縮至初體積的10%，加入乙醇至最終體積分數占比為80%，4℃條件下醇沉12 h，離心除去上清液，然后依次用無水乙醇、石油醚、丙酮洗滌，凍干，得黑菊芋多糖凍干粉。黑菊芋多糖用S-8大孔樹脂靜態吸附脫色除去類黑精，透析、濃縮、醇沉、洗滌、再次凍干。將DEAE纖維素柱用蒸餾水平衡好后，首先以蒸餾水對黑菊芋多糖進行洗脫，然后用0.1 mol/L～0.5 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，流速0.6 mL/min，同時以每管10 mL收集并跟蹤檢測多糖含量，合并含糖的洗脫液，冷凍干燥得黑菊芋純化多糖，經300 Da的透析膜透析后用于益生活性的評價。

1.3.4 紅外光譜分析

稱取1.0 mg黑菊芋純化多糖，在瑪瑙研缽中加入100 mg KBr粉末，充分研磨均勻，壓成薄片，用紅外光譜分析儀在4 000 cm-1～400 cm-1進行掃描。

1.3.5 紫外掃描分析

黑菊芋純化多糖凍干粉用蒸餾水配制成1.0 mg/mL的溶液，用紫外分光光度計在200 nm～400 nm波長下掃描，觀察記錄在波長260 nm和280 nm時，黑菊芋純化多糖的吸光度。

1.3.6 各種糖分含量分析

稱取適量黑菊芋，對其主要糖分進行檢測分析。采用苯酚-硫酸法檢測總糖含量[12]，二硝基水楊酸法檢測還原糖含量[13]；總糖含量減去還原糖含量得菊糖含量；采用GB 5009.8—2016《食品安全國家標準食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》檢測果糖、葡萄糖、蔗糖的含量[14]。

果糖的檢測條件：色譜柱為AgilentZORBAXNH2柱（5.0 μm×4.6 mm×150 mm）；流動相為乙腈-水（體積比70∶30），等度洗脫，流速為 1 mL/min；進樣量 1.0 μL；柱溫30℃。檢測器為蒸發光散射檢測器（evaporative lightscattering detector，ELSD），漂移管溫度 80℃～90℃，氮氣壓力350 kPa；撞擊器:關。

低聚果糖的檢測[15]，以蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖為標準品制作標準曲線。色譜柱：Agilent ZORBAX NH2柱（5.0 μm×4.6 mm×150 mm）；流動相為乙腈-水（體積比 75∶25）。進樣量為 5 μL～10 μL。漂移管溫度80℃～90℃，氮氣壓力350 kPa；撞擊器:關。

1.3.7 黑菊芋純化多糖的益生活性評價

參試的乳桿菌菌株有2個，分別為植物乳桿菌ZL9和干酪乳桿菌GL6。將參試乳桿菌活化復壯備用，配制無糖的MRS液體培養基，調節pH值至6.0。按照培養基中葡萄糖的比例分別加入葡萄糖、果糖、低聚果糖、去除單糖的鮮菊芋純化多糖和去除單糖的黑菊芋純化多糖。無糖的培養基用CK表示，含有葡萄糖、果糖、低聚果糖、去除單糖的鮮菊芋純化多糖和去除單糖的黑菊芋純化多糖的培養基分別用代號G、F、FOS、RJPS、BJPS表示，每個處理設3次重復。然后將配制好的液體培養基分裝入瓶中，分裝體積為22.5 mL。以CK培養基作為對照，菌種接種量1%，37℃條件下厭氧培養，分別于0、24、48 h測OD值和pH值，計算益生指數PI值[16]。

式中：APP0和APP48分別為益生菌培養0、48 h的吸光值（碳源為除葡萄糖外其他糖）；APG0和APG48為碳源為葡萄糖時益生菌培養 0、48 h的吸光值；APN0和APN48為益生菌在CK培養基上培養0、48 h的吸光值。

1.4 數據處理

本研究中的每個處理均進行3次平行試驗，表格中的數據以平均值±標準差表示，采用DPS V 7.05軟件處理數據，組間差異顯著性比較以單因素方差分析（One-way ANOVA）進行，并做 Turkey檢驗，當 P＜0.05時表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 黑菊芋多糖的提取

2.1.1 單因素試驗

不同提取條件對黑菊芋多糖得率的影響見圖1～圖3。

圖1 不同超聲時間對多糖得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic time on the yield of polysaccharide

圖2 不同超聲溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic temperature on the yield of polysaccharide

圖3 不同料液比對多糖得率的影響Fig.3 Effects of material liquid ratio on the yield of polysaccharide

由圖1可知，40 min～60 min時，隨著超聲時間的增加，得率逐漸升高，超聲時間60 min時，黑菊芋多糖的得率最高。這是由于超聲波的空化效應增強了溶劑水進入溶質內部的能力，使多糖更易于從細胞中釋放出來，縮短提取時間，提升提取率。超聲時間的長短很關鍵，時間太短，原料中的多糖不能充分溶解，時間過長，多糖會降解，甚至其中的五碳環或六碳環會裂解轉變為單糖、寡糖或低聚糖，在醇沉過程中有所損失，導致提取率的下降[17]。由圖2可知，采用水提法提取黑菊芋多糖，超聲溫度在60℃～70℃時，多糖的得率隨溫度升高逐漸增加，至70℃達到最高值，之后逐漸下降。原因可能是隨著溫度升高多糖的溶解度逐漸升高，前期多糖得率有所上升，但是隨著溫度的持續升高，多糖會發生分解，同時美拉德反應加劇，多糖和氨基酸發生反應，有所消耗，造成多糖含量的下降。由圖3可知，隨著提取劑用量的增加，多糖得率呈現先逐漸增加后減小的趨勢，料液比1∶20（g/mL）時多糖得率最高。這是因為提取溶劑用量低時，體系水分含量較少，黑菊芋多糖無法與水充分接觸，溶解不夠充分，不利于多糖溶出，故得率較低；隨著體系含水量增加，多糖充分溶脹，得率增加。但是，提取溶劑用量過多會影響超聲處理過程中的空化效應和機械振動效果，反而會使多糖得率下降。

2.1.2 正交試驗結果

正交試驗、極差和方差分析結果見表1和表2。

表1 正交試驗設計及結果分析Table 1 Orthogonal design and results

表2 正交試驗方差分析結果Table 2 Analysis results of orthogonal experiments

由方差分析F值和F臨界值關系可知，超聲溫度對黑菊芋多糖得率的影響極顯著（P＜0.01），超聲時間和料液比對黑菊芋多糖得率的影響不顯著（P＞0.05）。通過極差分析可知，影響黑菊芋多糖得率的各因素主次關系依次為超聲溫度＞料液比＞超聲時間，正交分析得最佳工藝條件為A3B2C1，即超聲溫度80℃，超聲時間 60 min，料液比 1∶15（g/mL）。在最佳工藝條件下進行3次平行試驗，得黑菊芋多糖得率平均值為49.98%。

2.2 黑菊芋純化多糖的紅外光譜分析

黑菊芋純化多糖的紅外光譜分析見圖4。

圖4 黑菊芋純化多糖的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of purified polysaccharide from black jerusalem artichoke

FT-IR分析可以作為化合物種類的鑒定依據。單糖、糖苷鍵和功能團的種類可以通過FT-IR鑒定[18]。從圖4可以看出，受試樣品在3440cm-1處有較強的振動吸收峰，表明分子間或者分子內有-OH[19]；在2 935 cm-1有吸收峰，說明分子內有C-H；1 652 cm-1為-OH的彎曲振動吸收峰[20]，1 450 cm-1為-CH（OCH2）彎曲振動吸收峰；1 035 cm-1為-CO 伸縮振動峰；925 cm-1～1 035 cm-1之間主要為C-C和C-O的特征吸收，說明提取物中主要為多糖類物質；925 cm-1和820 cm-1附近為果糖的β-糖苷鍵[21]，研究結果表明，純化得到的粉末為多糖類物質。

2.3 黑菊芋純化多糖的紫外掃描結果

黑菊芋純化多糖的紫外掃描結果見圖5。

圖5 黑菊芋純化多糖在不同波長條件下的吸光度Fig.5 Absorbance of black jerusalem artichoke purified polysaccharide at different wavelengths

采用紫外分光光度計對多糖溶液進行全波長掃描，可以驗證經氯仿-正丁醇法除蛋白和DEAE纖維素柱純化后的黑菊芋多糖的狀態。由圖5可知，黑菊芋純化多糖溶液在260 nm和280 nm處都沒有明顯的吸收峰，說明獲得的黑菊芋樣品純度較高，其中沒有或者只有微量的蛋白質和核酸等成分的存在。

2.4 各種糖分含量分析

果糖標準曲線方程：Y=2 221.4X+310.7，R2=0.9993；葡萄糖標準曲線方程：Y=1 944.9X+472.4，R2=0.999 7；蔗糖標準曲線方程：Y=2 597.7X+222.0，R2=0.9993。蔗果三糖標準曲線方程：Y=38.073X+1.066 5，R2=0.999 8；蔗果四糖標準曲線方程：Y=29.624X+1.355 1，R2=0.998 9；蔗果五糖標準曲線方程：Y=32.303X+2.4215，R2=0.9996。

按照1.3.6方法，測得黑菊芋的總糖含量為33.81 g/100 g，還原糖含量為9.71 g/100 g，菊糖含量為24.1 g/100 g。根據蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的標準曲線，計算得出黑菊芋樣品中的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖含量分別為1.63、7.92、6.22 g/100 g。這3種糖的含量占總糖含量的46.64%，菊糖含量的65.44%。推測低聚果糖是黑菊芋多糖的主要成分，且占比接近50%，這有利于其發揮益生活性。

2.5 黑菊芋多糖的益生活性

不同種類的糖對發酵液pH值的影響見圖6。不同乳桿菌菌株培養基48 h的PI值見表3。

圖6 含有不同種類糖的培養基pH值變化情況Fig.6 Changes of pH value of medium containing different kinds of sugars

表3 不同乳桿菌菌株48 h培養基PI值Table 3 PI value of medium of different Lactobacillus strains at 48 h

細菌對碳水化合物的利用情況可通過培養液的pH值變化和PI值的大小來衡量，有文獻表明，pH值變化與乳桿菌的生長情況有相關性，乳桿菌生長越快，培養液的pH值下降越明顯[16]。由圖6可知，以不同糖為碳源的培養液的pH值變化有所不同。2種乳桿菌株在CK培養基雖然能夠生長，但其pH值均在6.4以上，說明長勢一般[16]。以葡萄糖、果糖和去除單糖的黑菊芋純化多糖為碳源的培養液pH值均低于4.0，而以低聚果糖和去除單糖的鮮菊芋純化多糖為碳源的培養液pH值在5.5到6.3之間；由表3可知，2種乳桿菌菌株發酵低聚果糖的PI值均在0.66以上，發酵去除單糖的黑菊芋純化多糖的PI值均在0.80以上，發酵去除單糖的鮮菊芋純化多糖的PI值在0.58以上。去除單糖的黑菊芋多糖對植物乳桿菌ZL9的益生活性顯著高于低聚果糖（P＜0.05），但對干酪乳桿菌菌株GL6的益生活性與低聚果糖差異不顯著（P＞0.05）；去除單糖的黑菊芋純化多糖對2種乳桿菌菌株的益生活性均顯著高于去除單糖的鮮菊芋純化多糖（P＜0.05），這與黑菊芋多糖中低聚果糖比例較高有一定的相關性，李琬聰[22]研究表明除去二聚糖外，菊糖的生物活性與聚合度之間遵循“低聚合度活性高”的規律，三聚菊糖和四聚菊糖表現出最佳活性。

3 結論

本研究以黑菊芋為原料，以水為溶劑，采用超聲輔助法提取黑菊芋多糖，確定了黑菊芋多糖超聲輔助提取的較優條件為超聲溫度80℃、超聲時間60 min、料液比1∶15（g/mL），在此條件下進行3次平行試驗，黑菊芋多糖平均得率為49.98%；黑菊芋多糖組成以果糖、葡萄糖、蔗糖和低聚果糖為主，體外益生活性研究表明，黑菊芋多糖可有效促進植物乳桿菌菌株ZL9和干酪乳桿菌菌株GL6的增殖，具有較好的益生活性。本研究為黑菊芋的推廣應用和深度開發提供了理論依據。