速凍調制食品中沙門氏菌及干擾菌的分離與鑒定

黃寶瑩，佘之蘊，李沅鎂，金佳佳，張娟

（廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 佛山 528000）

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，種類繁多，目前已檢測出2 500多種沙門氏菌血清型[1-2]。沙門氏菌歸于腸桿菌科沙門氏菌屬，分為6個亞屬[3]，是革蘭氏陰性短小桿菌，無莢膜，無芽胞，多數有鞭毛，有動力。引起食物中毒最常見的沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等[4-5]，可導致腸熱癥、慢性腸炎、食物中毒等。沙門氏菌的傳播媒介多為肉、蛋、乳類食品。根據歐洲食品安全局（European Food Safety Agency，EFSA）統計，歐洲每年有超過10萬例的人類沙門氏菌病[6-7]。沙門氏菌是細菌性食物中毒中最常見的致病菌[8-9]。因此沙門氏菌檢測具有重要的衛生安全意義。

速凍調制食品是指以谷物或豆類或薯類及其制品、畜禽肉及其制品、水產品及其制品、植物蛋白及其制品、果蔬及其制品、蛋及其制品、食用菌及其制品等為主要原料，配以輔料（含食品添加劑），經調味制作加工，采用速凍工藝（產品熱中心溫度≤-18℃），在低溫狀態下貯存、運輸和銷售的預包裝食品，可分為花色面米制品、裹面制品、調味水產品、肉糜類制品、菜肴制品、湯料制品等[10]。速凍調制食品品種繁多，基質復雜，尤其是生制速凍調制食品，未經高溫或其他殺菌處理，存在大量非沙門氏菌屬雜菌，對沙門氏菌分離和鑒定造成一定難度。傳統檢驗方法操作繁瑣，受到檢測人員自身影響很大，倘若檢測人員經驗不足，容易造成假陰性結果[11-12]。因此，選擇性平板分離和初篩試驗對目標菌和干擾菌的準確判斷，是整個檢測過程中的關鍵環節。為提高速凍調制食品中沙門氏菌的檢驗能力和準確度，本文對速凍調制食品中沙門氏菌及其干擾菌進行分離和鑒定，有助于分析其污染情況，為企業生產加工過程食源性致病菌的來源與控制、日常檢測提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 標準菌株

甲型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50093：廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心。

1.2 培養基和試劑

氯化鈉（分析純）：西隴科學股份有限公司；緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（tetrathionate broth base，TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（selenite cystine broth，SC）、亞硫酸鉍瓊脂（bismuth sulfite agar，BS）、沙門氏菌顯色培養基、三糖鐵瓊脂（triple sugar iron agar，TSI）、賴氨酸脫羧酶生化鑒定試劑盒、氨基酸脫羧酶對照生化鑒定試劑盒、營養瓊脂培養基（nutrient agar，NA）：廣東環凱微生物科技有限公司；革蘭氏陰性桿菌鑒定（gram-negative identification card，GN）卡：生物梅里埃公司。

1.3 儀器和設備

HVA-85高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；GHP-9160隔水式恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；Bagmixer 400SW拍打式均質器、DiluFlow全自動電子稀釋儀：法國Interscience公司；1300 SERIES A2生物安全柜：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定系統：法國生物梅里埃股份有限公司。

1.4 樣品

速凍調制食品樣品共307批次，分為6類，由廣東產品質量監督檢驗研究院提供，其分類和數量情況見表1。

表1 樣品分類和數量Table 1 Categories and number of samples

1.5 試驗方法

參照GB 4789.4—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[13]對307批次速凍調制食品進行沙門氏菌檢測。檢驗過程以甲型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50093作為陽性對照菌株。

1.5.1 預增菌

稱取25 g樣品置于無菌均質袋，使用全自動電子稀釋儀加入225 mL BPW，用拍打式均質器拍打2 min，于36℃培養18 h。

1.5.2 增菌

輕輕搖動培養過的樣品混合物，移取1 mL，轉種于10 mL SC內，于36℃培養24 h。同時，另取1 mL，轉種于10 mL TTB內，于42℃培養24 h。

1.5.3 分離

使用接種環分別從SC和TTB中取增菌液1環，劃線接種于BS瓊脂平板和沙門氏菌顯色培養基平板，于36℃分別培養48 h（BS瓊脂平板）和24 h（沙門氏菌顯色培養基），觀察各個平板上生長的菌落。

1.5.4 初篩試驗

自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種TSI，先在斜面劃線，再于底層穿刺；同時接種賴氨酸脫羧酶生化鑒定管和氨基酸脫羧酶對照生化鑒定管，并加滅菌液體石蠟5滴覆蓋培養基表面。于36℃培養24 h，必要時可延長至48 h。根據表2進行初步判定。

表2 沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基的反應結果Table 2 The reaction results of Salmonella in TSI and lysine decarboxylase test medium

1.5.5 純化與革蘭氏染色

初步判斷為可疑沙門氏菌的樣品，劃線接種于NA，于36℃培養24 h后，進行革蘭氏染色。

1.5.6 生化鑒定

革蘭氏染色結果為陰性的樣品，從NA上挑取可疑菌落，使用VITEK 2 COMPACT進行鑒定。用0.45%鹽水制備麥氏比濁度為0.5～0.63的菌懸液，填充到GN卡內，放入孵育倉，儀器每隔15 min自動閱讀孵育倉內所有卡片，并將數據傳入電腦，4 h～12 h后自動打印結果[14]。VITEK 2 COMPACT以現有的生化鑒定方法為基礎，同時開發了新的底物用來檢測碳源利用的同化試驗，可以使用更多類型的底物，也就是可以利用更多的鑒定反應。其檢測原理是儀器透過光學原件檢測光穿過64個含有菌液的孔后相應的光強度變化值，對多種顏色變化進行檢測（430、568、660 nm 3種波長）。

2 結果與分析

2.1 分離結果

沙門氏菌屬在BS瓊脂平板上菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養基不變。在沙門氏菌顯色培養基平板上菌落為品紅色。選擇性瓊脂平板上可疑或典型沙門氏菌分布情況如表3所示。

表3 選擇性瓊脂平板上可疑或典型沙門氏菌分布情況Table 3 Distribution of suspicious or typical Salmonella in selective agar plate

表3顯示，有可疑或典型菌落生長的樣品共128批次，可疑率為41.69%。

2.2 初篩試驗結果

對上述128批次可疑樣品進行三糖鐵和賴氨酸脫羧酶初篩試驗，分布情況見表4。

表4 初篩試驗結果分布情況Table 4 Distribution of preliminary screening test results

由表4可知，初步判定為可疑沙門氏菌屬的樣品共50批次，可疑率為16.29%。

2.3 生化鑒定結果

對50批次可疑樣品進行生化鑒定，結果如表5所示。

表5 生化鑒定結果Table 5 Results of physiological and biochemical identification

續表5 生化鑒定結果Continue table 5 Results of physiological and biochemical identification

由表5可知，檢出沙門氏菌3批次，檢出率為0.98%。檢出干擾菌47批次，其中Aeromonas hydrophila/caviae（嗜水氣單胞菌/豚鼠氣單胞菌）、Aeromonas sobria（溫和氣單胞菌）、Escherichia coli（大腸埃希菌）、Escherichia fergusonii（弗格森埃希菌）、Klebsiella pneumoniae ozaenae（肺炎克雷伯菌臭鼻亞種）、Providencia rettgeri（雷氏普羅威登斯菌）、Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌）、Pseudomonas luteola（淺黃假單胞菌）、Raoultella ornithinolytica（解鳥氨酸拉烏爾菌）、Serratia liquefaciens group（液化沙雷菌群）各檢出1批次，檢出率為0.33%。Citrobacter amalonaticus（無丙二酸檸檬酸桿菌）、Cronobacter sakazakii group（克羅諾桿菌屬）、Enterobacter cloacae complex（陰溝腸桿菌群）、Klebsiella oxytoca（產酸克雷伯菌）、Pantoea spp（泛菌屬）檢出2批次，檢出率為0.65%。Morganella morganii ssp morganii（摩氏摩根菌摩根亞種）、Serratia marcescens（粘質沙雷菌）檢出3批次，檢出率為0.98%。Proteus miralbilis（奇異變形桿菌）檢出4批次，檢出率為1.31%。Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae（肺炎克雷伯菌肺炎亞種）檢出17批次，檢出率為5.54%。

3 討論與結論

BPW是非選擇性培養基，能使處于瀕死狀態的細菌恢復活力，用于修復受損傷的沙門氏菌，但由于其不具有選擇性，因此增菌時間過長會導致雜菌生長過多，干擾鑒定結果，故建議最好控制在8 h～18 h。

SC和TTB是選擇性增菌液，能使沙門氏菌優勢繁殖，其它細菌受到抑制[15]。SC中的亞硒酸氫鈉抑制革蘭氏陽性菌和非沙門氏菌的大多數革蘭氏陰性腸道菌，胱氨酸能促進沙門氏菌屬生長，適合傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌生長，最適培養溫度為36℃。TTB中硫代硫酸鈉和四硫磺酸鈉結合可抑制腸道共生菌，而具有四硫磺酸鈉還原酶的細菌能在此培養基中繁殖；膽鹽和煌綠可抑制大腸群菌和其它革蘭氏陽性細菌，適合其他沙門氏菌生長，最適培養溫度為42℃。為防漏檢宜同時采用SC和TTB進行選擇性增菌。

BS中的亞硫酸鉍指示劑抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群，硫酸亞鐵用于產生硫化氫，并與鐵產生沉淀，使陽性培養物為具有金屬光澤的棕色到黑色菌落，可延長培養時間以免沙門氏菌生長被抑制，適合沙門氏菌特別是傷寒沙門氏菌的選擇性分離培養。沙門氏菌顯色培養基中的膽鹽抑制革蘭氏陽性菌，混合色素分別與沙門氏菌和大腸菌群所對應的酶發生特異性反應，水解底物，釋放出顯色基團，在淡黃色平板上沙門氏菌產生品紅色的菌落，大腸菌群產生藍綠色的菌落。沙門氏菌顯色培養基靈敏度高，選擇性強，可排除多數干擾菌，減少大量的鑒定工作，提高檢測效率，BS選擇性較差，但可提高檢測準確度，減少誤判。采用BS搭配沙門氏菌屬顯色培養基進行分離，互補防漏檢。

三糖鐵瓊脂用于鑒別細菌發酵蔗糖、乳糖、葡萄糖及產生硫化氫的生化反應。乳糖、葡萄糖、蔗糖為可發酵糖類，其產酸時通過酚紅指示劑測出，酸性呈黃色，堿性呈紅色；硫代硫酸鈉可被某些細菌還原為硫化氫，與硫酸亞鐵銨中的鐵鹽生成黑色硫化鐵。若細菌可發酵3種糖產酸，酚紅指示劑變黃，則試管斜面和底層均變黃。若細菌只能發酵葡萄糖，則斜面少量的葡萄糖被分解完后，細菌繼續利用蛋白胨產堿，且產堿量大于產酸量，最終由黃變為深紅，底層無氧，細菌緩慢分解葡萄糖而產酸變黃。若細菌只能發酵葡萄糖和乳糖，或者只能發酵葡萄糖和蔗糖，由于乳糖或蔗糖量大，故斜面和底層均產酸變黃。若分解糖類產氣則可見氣泡或裂縫。沙門氏菌一般生化特性是利用葡萄糖產酸產氣，產H2S，不發酵乳糖和蔗糖[16]。故選擇性培養基就是加入乳糖、酸堿指示劑兩個指針來判斷可疑菌落。但這些一般生化特性并不是沙門氏菌的特異性生化特性，如本次試驗中粘質沙雷菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌肺炎亞種等干擾菌在三糖鐵瓊脂和選擇性培養基上生化結果與菌落形態與沙門氏菌相似。

速凍調制食品基質多樣復雜，存在大量營養要求和生化反應相似的非沙門氏菌干擾菌，而沙門氏菌血清型高達2 500多個，不同血清型的沙門氏菌其營養要求和生化反應差異較大，增菌和分離既要考慮選擇性，又要兼顧特異性，因此對檢驗人員的操作水平和經驗有著較高的要求。本次試驗在選擇性瓊脂平板上的可疑率為41.69%。初篩試驗后可疑率為16.29%。沙門氏菌檢出率為0.98%。結果表明，速凍調制食品中存在大量非沙門氏菌干擾菌。使用VITEK 2 COMPACT對可疑菌落進行生化鑒定，共鑒定19種干擾菌。其中嗜水氣單胞菌/豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌是多種水生動物的原發性致病菌[17-18]；銅綠假單胞菌[19]、克羅諾桿菌屬[20]是食源性致病菌；其余均為條件致病菌，應引起重視并進行深入的致病性研究。