中性粒細胞胞外誘捕網在膿毒癥中的作用機制與靶點

王瀚黎，田圓綜述 梁群審校

膿毒癥(sepsis)是由于嚴重感染的生理反應失調所引起的危及生命的器官功能障礙[1]。膿毒癥未得到及時救治可導致嚴重膿毒癥、休克及多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，膿毒癥患者的住院時間更長，其住院期間病死率更高[2]。膿毒癥的發病率與病死率高，發病機制復雜，是重癥醫學領域的重點研究對象，對膿毒癥的成因、進展及其臨床治療的研究和探討在不斷深入。最新的研究認為，中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)在這一進程中發揮了重要的作用[3]。本文以NETs的研究作為切入點，探討其在膿毒癥病理過程中的角色。

1 NETs的發現與研究現狀

1.1 NETs的發現、定義與結構 自2004年，Brinkmann等使用脂多糖(LPS)來誘導家兔外周循環中的中性粒細胞，首次發現了中性粒細胞胞外誘捕網，這是免疫系統中新發現的一種消滅病原體的方式[4-5]。這種新的免疫細胞殺傷病原微生物的機制是由核DNA構成了其結構骨架，在核DNA的骨架上附著有抗菌肽、組蛋白等多種殺菌因子，這些成分在NETs捕獲并殺死病原微生物的過程中起到了關鍵的作用[6]。在電子顯微鏡中可以看到，核DNA絲的直徑為15～17 nm，其上鑲嵌的多種球形殺菌因子直徑約25 nm，其中有多種組蛋白和中性粒細胞彈性酶(NE)[7]。在中性粒細胞中各類組蛋白約占蛋白總數的70%，其他成分還包含組織蛋白酶G等[8-9]。其他研究表明,NETs中還含有基質金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、組織因子(TF)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和纖維蛋白原(Fibrinogen，Fg)等成分[9-12]。

1.2 NETs的生成 目前已有3種途徑被證明可以誘導NETs生成，并且不同的誘導方式使得NETs的形成方式出現了差異[13]：(1)金黃色葡萄球菌誘導中性粒細胞核膜的破裂，核膜形成的囊泡包裹著DNA轉移至細胞膜上，這些囊泡與細胞膜融合并向細胞外釋放其中包裹的DNA，便形成了NETs，這一過程需要30～60 min的時間[14]。在這一方式中，中性粒細胞的細胞核和細胞膜并不會遭到完全的破壞，細胞的活性和吞噬功能是被保留下來的，所以也稱為活性NETs[15]。(2)在肉豆豆酸酯(PMA)介導下，中性粒細胞核膜發生了降解，其中包裹的染色體去致密化，最終在經過3～4 h后導致整個細胞的裂解；另一些研究則表明這種去致密化的途徑受到NE和髓過氧化物酶(MPO)協同的影響[16-17]，而以上這一過程中，被激活的中性粒細胞變為扁平，染色質裂解，進而死亡，所以也被稱為自殺性NETs[15]。(3)還有一種由ROS依賴的中性粒細胞釋放線粒體DNA的NETs形成機制，該機制未完全闡明，有待進一步研究[18]。

中性粒細胞是人體免疫防御的主陣地，NETs被證明在殺滅病原微生物的過程中作用顯著[19]，是免疫系統的重要一環；NETs在膿毒癥病理過程中，除了殺滅病原體，對凝血功能、血管內皮也有影響[20-21]。此外，NETs在其他炎性反應、免疫等相關疾病中，也有較為廣泛的影響：NETs參與動脈粥樣硬化的病理過程[22]；NETs在系統性紅斑狼瘡、糖尿病、阿爾茨海默病、腫瘤當中都發揮著作用[23-26]。

2 NETs作用途徑機制

在膿毒癥的病理過程中，對于人體免疫系統具體是如何發揮作用的并沒有定論，目前較為公認的觀點是Bone提出的：人體促炎反應和抗炎反應之間的失衡在膿毒癥病理過程中扮演了重要角色，在二者交替制衡的復雜機制過后，最終導致致命性的免疫抑制；而過往的研究已經證實，NETs在這一過程中發揮了其特有的作用[27]。目前認為其在殺滅病原體的同時也造成了凝血功能障礙并使血管內皮損傷[28-30]。

2.1 NETs殺滅病原微生物 NETs殺滅病原微生物的主要原理是通過其網狀結構來捕獲和固定病原體，這樣就可以阻止病原體在人體內無序的擴散，并使其長時間暴露于局部的高濃度抗菌蛋白中以便各種殺菌成分對病原體進行殺傷。實驗證明，NETs可以快速地殺滅病原微生物，其具備迅速地隔離病原微生物表面結合陽離子的能力，可以破壞病原微生物細胞膜的完整性并溶解細胞，可以在幾分鐘內殺滅病原微生物[26]；在NETs殺傷的過程中，DNA結構完整性非常重要，一旦DNA結構被破壞，脫氧核糖核酸酶(DNase)會導致NETs失去殺菌能力,在體外試驗中，向細菌中添加經過稀釋的DNA后，通過干預DNase的水平，細菌的生存率會隨著DNase水平的降低而降低[31]。在較早的一項臨床試驗中，也有研究者指出，循環中的游離DNA(cfDNA)水平與多器官功能障礙評分、白細胞計數和MPO水平相關聯，但是其具體關系受限于樣本量并未得出有效的結論，在該項研究中cfDNA與患者病死率呈正相關[32]。

而作為NETs中重要的殺菌成分——組蛋白[6]，它的抗菌能力是在1942年被首次發現的，組蛋白中有2個H2A-H2B二聚體和1個H3-H4四聚體[33-34]，H2A-H2B的抗體可以拮抗NETs的殺傷作用。H2A以2 mg/L的濃度可以在半小時內殺死金黃色葡萄球菌，其效果甚至優于一些經典抗生素[35-36]。但在組蛋白殺滅病原體的同時，其在血液中的濃度被認為與膿毒癥病死率呈正相關，并且純化的組蛋白可以直接對心、肺等臟器造成損傷，也介導了強烈的炎性級聯反應，促進凝血反應，而尚沒有特定靶點或者藥物可以及時阻斷這一系列反應，對膿毒癥患者來說，兇險的免疫抑制會不可避免的發生，這是致命的[33-37]。

2.2 NETs與膿毒癥凝血功能障礙 膿毒癥可誘發全身凝血系統激活，最終導致嚴重的凝血功能障礙，在膿毒癥的初期，炎性因子大量釋放進入外周循環促使機體進入一種高凝狀態，在這種狀態下與凝血相關物質將會被大量消耗，所以在接下來的疾病進程中，患者將處于一種異常的病理性低凝狀態，并在下一個階段出現繼發性纖溶亢進[38]。而NETs在這一過程中主要起到促凝作用，它會增加血小板黏附、活化和聚集的程度，促使血小板血栓形成，這一過程本身是一種人體防御機制，它的作用在于可以將病原體隔離在一個相對固定的區域內并進行直接的殺傷，但這一機制同時也可能會導致DIC的發生幾率增加[39]。也有研究表明，另一種模式也會增加血栓的生成，以往的實驗中，NETs的各個組成成分已經被證明可以激活凝血系統，McDonald等[40]則在小鼠的膿毒癥模型中觀測到了對于NETs、血小板、凝血酶之間相互作用的一條軸線，血小板血栓的空間位置和NETs空間位置有明顯關聯性，NETs的增加促進了小鼠血管內凝血的發展。另一項研究中則證實[41]革蘭陰性菌釋放的脂多糖可以快速的激活血小板，并誘導中性粒細胞遷移到感染部位，并通過與血小板的相互作用形成聚集體。LPS激活中性粒細胞，釋放NETs，并在TF的作用下，形成血小板血栓，并破壞血管內皮。

2.3 NETs在膿毒癥中造成血管內皮損傷 內皮細胞是血管與組織間的屏障，對感染起到了防御作用，血管內皮通透性升高被認為會加重膿毒癥炎性反應與免疫反應。關于NETs是如何調節血管內皮通透性的，目前的研究仍處于早期階段，僅對其具體的影響和可能的機制進行探討[42]。研究表明，肽基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4)直接干預NETs的生成，通過這種途徑來抑制NETs，可以明顯地降低膿毒癥小鼠的肺損傷程度和肺血管通透性[43]。有研究證明，NETs的組成成分之一——瓜氨酸化組蛋白3通過破壞細胞間的黏附連接而導致微血管的滲漏，使血管內皮功能出現障礙，并增加了白蛋白滲出[44-45]。在另一些研究中，NETs當中富含的NE和基質金屬蛋白酶等也會破壞內皮細胞的連接，會進一步增加其滲漏性[46]。在健康獻血者的血液中進行試驗，可以觀察到隨著血管內皮細胞和NETs接觸時間的延長，血管內皮細胞的損傷程度明顯加重，并且在更早的試驗中膿毒癥患者血液中也觀察到了類似的現象[47-49]。

3 干預NETs來治療膿毒癥

cfDNA被報道可以作為感染性疾病的敏感性臨床檢測指標[28]。Dawulieti等[50]發現膿毒癥的促炎反應是被cfDNA影響的，它可能是通過第三代聚酰胺-胺樹狀大分子(PAMAM-G3)來調節的，該項研究中證實，PAMAM-G3在體外和CLP小鼠模型中都可以阻斷Toll樣受體9(TLR9)活化，這是一種可以清除促炎物質的聚合物，可以顯著地降低膿毒癥患者腫瘤壞死因子α水平，所以PAMAM-G3可能具有對膿毒癥的治療潛力[51]。

Toll樣受體4(TLR4)是膿毒癥的經典通路，它存在于血小板中，并可以直接誘導NETs的生成，而通過抑制TLR4的手段進行干預，可以改善膿毒癥患者的預后[52]，這可能是治療膿毒癥的潛在靶點。對TLR4的干預可以影響早期膿毒癥中的炎性級聯反應[53]，但是對其徹底阻斷也有可能會導致機體對內毒素的免疫反應完全失靈，所以筆者認為對其在臨床中的應用應采取謹慎態度。

PAD4可以影響NETs的形成，敲除PAD4基因的膿毒癥小鼠模型抑制了NETs的生成，存活率提高，器官功能障礙程度降低[54-55]。另有研究則證實應用PAD4抑制劑既可以影響小鼠中性粒細胞中的整合素相互作用蛋白-3(kindlin-3)，又可以抑制由NETs引起的免疫血栓形成[56]。因此，PAD4可能是抑制NETs和減少血栓生成的治療靶點。這也是在膿毒癥的治療過程中比較受到關注的內容。

NLRP3炎性小體(一種檢測致病微生物和應激源的復合蛋白)與白介素-1β之間存在交互作用，即NLRP3炎性小體可以激活IL-1β，反之亦然[57]。而白介素-1β是NETs的關鍵誘導因子，則可以認為干預NLRP3炎性小體也可以干預NETs的水平，進而實現對膿毒癥的治療。格列本脲原本是治療糖尿病的一種藥物，但是在研究中發現其可以阻斷NLRP3炎性小體的激活，但在臨床研究中發現其抑制NLRP3炎性小體激活所需劑量過高，會造成較為嚴重的低血糖[58]；但格列本脲的一種中間底物——16673-34-0，既可以阻斷NLRP3炎性小體又不會造成低血糖，它可能會成為一種潛在的替代藥物[59]。另一種潛在的藥物是秋水仙堿，它可以抑制P2X7 ATP受體上的NLRP3炎性小體，并對中性粒細胞的多項功能有調控作用[60]，這也對膿毒癥的治療提供了可能的方向。

而針對前文中提到的組蛋白與NE等成分，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)可以阻斷NETs的生成[61]，NE抑制劑則已被證實在膿毒癥急性肺損傷和彌漫性血管內溶血方面是非常有潛力的[62]。

4 總結與展望

綜上所述，NETs在膿毒癥病理過程中起到了重要的作用，其對病原體進行殺傷，且其殺傷病原體的效果可能強于一些典型抗菌類藥物。但是也不可以放任NETs無限增長，因為在人體中NETs數量的增加也會顯著增加血管中免疫血栓的形成，增加DIC的風險，且會造成血管內皮損傷，這都會升高膿毒癥患者病死率。所以對于通過干預NETs的生成和調節其表達來治療膿毒癥的方法應該是謹慎的，但也是非常值得深入探討的。目前來看，根據對患者指標的衡量來控制NETs的水平可能是較適合的治療方式，這也意味著對能夠敏感體現NETs水平的有特異性且便于測量的生物標志物將會是非常有價值的；而對NETs影響血管內皮功能的研究可能是未來的研究方向。并且在其他領域的研究中發現，除中性粒細胞外，嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞均被觀察到可以釋放胞外誘捕網，所以認為胞外誘捕網可能是一種免疫相關細胞的特殊機制，但是其具體的功能和可能的干預措施均有待研究。相信通過對NETs研究的深入，并合理干預NETs的水平，可以使患者獲得健康。