不同輪作模式下高發小麥赤霉病土壤真菌多樣性變化

路 妍，高 健，康文欽，袁喜麗，景 嵐

(1.內蒙古農業大學 園藝與植物保護學院，內蒙古 呼和浩特 010011；2.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；3.烏拉特中旗農牧業技術推廣中心，內蒙古 烏拉特中旗 015300)

小麥赤霉病又稱爛穗病，是由禾谷鐮孢菌復合種(Fusariumgraminearumcomplex)侵染引起的災害性病害[1]，世界各地均有發生，溫暖濕潤地區發生尤為嚴重[2]。該病害在我國主要發生在南方冬麥區，如長江中下游、川滇冬麥區和華南冬麥區等地，經常流行成災，已成為小麥主產區威脅最大的流行性病害[2]。東北春麥區由于雨熱同季，也發生嚴重，2010年以來病害呈現向北方擴展的趨勢[3]。2019年，黑龍江省6，7月降雨偏多，造成赤霉病偏重流行。

赤霉病不僅直接造成減產，同時由于病粒含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素，人、畜誤食病粒后會引起發熱、嘔吐、腹瀉流產、死胎等中毒反應，還有致癌、致畸和誘變的作用，嚴重的甚至導致死亡[4]。因此，我國規定小麥及其產品中DON和ZEN含量不得超過1 mg/kg和60 μg/kg。近年來，毒素污染問題時有發生，赤霉病高發地區毒素超標問題較為嚴重[5]。

在東北春麥區小麥赤霉病主要以菌絲、子囊殼在病株和麥殼上越冬，是第2年的主要初侵染源。秸稈還田導致田間赤霉病菌菌源量顯著增加，根際土壤生態環境惡化[6]。土壤微生物是土傳病害發生的引擎。農田土壤微生物群落結構主要受耕作方式和管理模式的影響。作物輪作模式下，由于多種作物組合，土壤微生物群落結構較單一作物模式發生變化，影響了土壤的生態功能[7]。目前，已有關于適宜作物通過與病原菌非寄主植物的輪作而顯著降低土壤中的病原菌數量的報道。王保通等[8]研究發現，油菜和小麥輪作降低了小麥全蝕病(Gaeumannomycesgraminis)的發病率。張麗紅等[9]報道，利用菊花—生菜—辣椒輪作增加了根圍芽孢桿菌數量，可使真菌數量降低。Cobo-Díaz等[10]研究發現，高適應性的拮抗微生物組合，對赤霉病防控有積極作用。加拿大、埃及和美國學者揭示了非洲傳統作物禾參的根圍細菌通過釋放殺菌物質阻斷赤霉菌對小麥根部的侵染[11]。于高波等[12]研究發現，小麥、毛苕子與黃瓜輪作有利于緩解黃瓜連作障礙，改善土壤微生態環境，提高黃瓜產量。

本研究利用ITS2擴增子測序技術，對東北春麥區幾種作物輪作種植模式下，土壤微生物群落組成、多樣性及小麥赤霉菌(Gibberellazeae)含量等特征進行了系統分析，以期揭示不同種植模式下土壤微生物類群特征以及對小麥赤霉菌含量的影響，為適宜的輪作系統推廣提供一定的理論指導。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于額爾古納市拉布大林農場(50°14′ N，120°08′ E)。該地區屬于大陸性亞寒帶氣候區，春季干旱多風，夏季溫涼短促、降雨相對集中，秋季降溫急劇，冬季寒冷漫長，年平均氣溫-5～-1 ℃，晝夜溫差大，雨熱同季。土質肥沃，自然肥力高，耕地集中連片。主要作物有春小麥、油菜、馬鈴薯、玉米、莜麥等。

1.2 試驗設計

試驗共設置5個處理：小麥-小麥-馬鈴薯輪作(T)、小麥-小麥-水飛薊輪作(MT)、小麥-小麥-油菜輪作(R)、小麥-小麥-甜菜輪作(S)、小麥-小麥-小麥連作(W)，以小麥連作3 a為對照。5個處理的試驗地在2018，2019年連續種植小麥，2020年5月2日播種各處理，每個小區試驗面積為6.67 hm2，不同處理的土壤肥力及管理方式相同，全程機械化種植，聯合收獲秸稈直接還田。

1.3 土壤樣品采集

2020年秋于作物收獲后采集土壤樣品，將小麥、馬鈴薯、油菜、甜菜和水飛薊整株拔出，除去根系周圍大塊土，收集根系周圍土壤樣品。每個小區5點取樣，共采集 25份土壤樣品，-80 ℃ 冰箱保存，用于DNA提取。

1.4 土壤微生物總DNA的提取和測序

1.4.1 土壤微生物總DNA提取 采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒(OMEGA)的方法進行樣本基因組DNA提取，并利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA進行精確定量。

1.4.2 目標片段PCR擴增及測序 引物設計以ITS2區的序列為靶目標，引物序列為：fITS7(5′-GTGARTCA

TCGAATCTTTG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATA

TGC-3′)。PCR總反應體系為42.5 μL(Pusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL、Forward Primer 2.5 μL、Reverse Primer 2.5 μL、DNA模板50 ng、H2O 25 μL)；PCR反應條件：98 ℃，30 s； 98 ℃，10 s；54 ℃，30 s；72 ℃，45 s，35個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃，∞。PCR擴增產物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目標片段，回收使用回收試劑盒(AMPure XT beads)。對純化后的PCR產物經Oubit對文庫進行定量。文庫檢測合格后，使用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序，應用試劑為MiSeq Reagent Kit V3。

1.5 數據處理

采用Cutadapt[13]先對reads進行低質量部分剪切，截去Barcode和引物序列，采用FLASH[14](Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.8，FALSH) 將每一對paired-end reads拼接合并成一條更長的tag，對測序reads進行窗口法質量掃描，掃描窗口默認為100 bp，當窗口內平均質量值低于20時，將read從窗口起始到3′終止的部分截掉，去除截短后長度小于100 bp的序列，去除截短后N(不確定模糊堿基)的含量在5%以上的序列，初步質控得到原始數據。然后采用Vsearch[15](v2.3.4，Vsearch)軟件將嵌合體序列過濾，最后進行Q20、Q30等質控分析，獲得最終clean data。

采用Vsearch算法，將序列相似性大于97%的clean tags定為1個OTU，挑選OTU的代表序列，采用QIIME[16]等軟件，利用UPARSE算法對unique序列在大于97%相似性條件下進行聚類，獲得OTU代表序列及其對應的豐度[17]。同時采用RDP 11.5和Unite數據庫(Ver.7.2，2017.06.28更新)對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學注釋分析，獲得不同分類水平(界門綱目科屬種)下5種種植模式的土壤中真菌物種豐度及微生物優勢菌群。之后利用QIIME和R軟件vegan包等對樣本進行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。最后對25份土壤樣本在不同分類水平的具體物種組成進行分析，從而找到小麥赤霉菌在不同土壤樣本中的含量。

2 結果與分析

2.1 不同輪作模式下土壤真菌測序結果及OTU統計分析

通過Illumina MiSeq測序平臺共獲得911 229條有效序列，81.50%的序列片段大小為200～300 bp，18.17%為300～400 bp。經97%的相似性聚類統計后共獲得1 586個OTUs，OTUs分布的韋恩圖表明，5個處理共有的OTUs數目為278個，占OTUs總數的17.53%。連作處理(W)特有的真菌OTU數目最多，為98個，占其總OTUs(389個)數目的25.19%。輪作馬鈴薯(T)、水飛薊(MT)、油菜(R)和甜菜(S)處理特有的真菌OTU占其各自總OTUs的比例分別為19.34%，14.35%，19.32%和10.73%(圖1)。

2.2 Alpha多樣性分析

通過稀釋曲線可以看到，所有曲線均趨于平緩，樣品的測序深度已到平臺期，證明測序數據量已飽和，可以覆蓋樣品中絕大部分真菌類群(圖2)。

選取4個常用的alpha多樣性指數進行分析，即Chao1、Shannon-wiener、Simpson和Good coverage(表1)。其中，Chao1指數可用來估計物種的數目，Chao1指數高，說明樣品物種數目多，群落的豐富度高。由表1可知，與W處理相比，R和S處理Chao1指數分別增加了11.08%，8.59%，且差異顯著(P<0.05)；MT和T處理Chao1指數減少了4.45%，7.44%；Chao1指數最高的R處理其OTU數目也最多，與之相比，2個指數值最低的處理T，其OTU數目也最少。Shannon和Simpson可以反映出對應群落的多樣性，Shannon 指數越大、Simpson 指數越趨近于1，則表示該處理下的樣品的物種多樣性越高。MT處理的Shannon指數高于W處理，R和T處理的Shannon指數略低于W處理，但差異不顯著(P>0.05)，S處理低于W處理，且差異顯著(P<0.05)。3種輪作處理R、MT、T的Simpson指數都高于W處理，且接近于1。S處理與W處理數值相等，差異不顯著(P>0.05)。上述結果表明，與連作處理W相比，輪作處理R和S增加了土壤真菌的豐富度，MT處理提高了土壤真菌群落的多樣性，且差異顯著(P<0.05)。

2.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性是指不同環境群落之間的物種差異性，本試驗通過主坐標分析(Principal coordinates analysis，PCoA)和UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)聚類分析對5個處理25份土壤樣本進行聚類分析，結果如圖3所示。由圖3-A可知，每個處理的5個重復都聚到一起，處理T與處理W距離較遠，處理間差異較大。由圖3-B可知，T處理和W處理的分支距離最遠，處理間真菌群落組成差異較大。

A.主坐標分析(PCoA)；B.Unweighted unifrac聚類樹分析。A.Principal coordinate analysis(PCoA)of unweighted Unifrac distances；B.UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)cluster analysis based on unweighted Unifrac distances.

2.4 不同輪作模式對土壤真菌群落結構的影響

2.4.1 不同輪作模式下土壤真菌門水平群落結構 在門水平，除少數真菌未被分類外，5種模式的土樣主要分布在8個優勢真菌門類(圖4)：子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、未知菌門(Fungi unclassified)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)、蟲霉門(Entomophthoromycota)。其中，子囊菌門為各模式的優勢菌群，相對豐度為65.15%～85.29%；其次相對豐度較高的為接合菌門(4.72%～22.48%)和擔子菌門(4.48%～8.45%)真菌。連作(W)較各輪作模式接合菌門、未分類的真菌豐度增加，子囊菌門和擔子菌門真菌豐度降低。

圖4 不同輪作模式土壤中門分類水平的真菌組成Fig.4 Fungal community composition in soil samples at the phylum level under different rotation patterns

2.4.2 不同輪作模式下土壤真菌屬水平群落結構 在屬水平上，5種處理的土樣共鑒定出275個真菌屬，W，R，S，MT，T分別為202，206，195，164，167個屬。圖5為各模式中豐度前20的真菌屬。其中共有的優勢屬有被孢霉屬(Mortierella)(4.68%～22.17%)、赤霉屬(Gibberella)(2.5%～4.9%)、柄孢殼菌屬(Podospora)(2.15%～8.01%)和鐮孢屬(Fusarium)(1.36%～3.14%)；被孢霉屬和鐮孢屬在連作(W)中豐度最高，赤霉菌屬在T中豐度最高(4.9%)，在S中豐度最低(2.5%)；R中漆斑菌屬(Myrothecium)豐度明顯高于其他處理，T中織球殼屬(Plectosphaerella)、柄孢殼屬和小壺菌屬(Spizellomyces)的豐度較其他模式高，S中四枝孢屬(Tetracladium)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)、鏈格孢屬(Alternaria)、小戴衛霉屬(Davidiella)和隱球菌屬(Cryptococcus)的豐度明顯高于其他模式。MT中光黑殼屬(Preussia)和毛殼屬(Chaetomium)的豐度明顯高于其他模式。

圖5 不同輪作模式土壤中屬分類水平的真菌組成Fig.5 Fungal community composition in soil samples at the genus level under different rotation patterns

2.4.3 不同輪作模式下土壤真菌優勢種分布 在種的分類水平上，5種種植模式土壤中共鑒定出438個真菌種，W、MT、T、S和R分別有278，282，269，278，309個。圖6為在各模式中相對豐度前10的真菌種，其中共有優勢種為Tetracladiummaxilliforme(1.07%～16.33%)、交鏈格孢(Alternariaalternata)(0.24%～10.59%)、長孢被孢霉(Mortierellaelongata)(0.69%～11.97%)、Podosporatetraspora(1.79%～6.27%)、小不整球殼菌(Plectosphaerellacucumerina)(0.46%～3.97%)。其中長孢被孢霉主要分布在W中，Tetracladiummaxilliforme和交鏈格孢在S中豐度較高，Podosporatetraspora在T中豐度較高，小不整球殼菌在S、T、MT和R中豐度均在3.00%以上，在W中豐度相對較低(0.46%)；Plectosphaerellaplurivora在T中豐度最高，S中也有分布，其他模式中沒有分布。

圖6 不同輪作模式土壤真菌優勢種分布Fig.6 The dominant species distribution of fungi under different rotation patterns

2.5 不同輪作模式下土壤真菌特異性

各種種植模式土壤均含有其特異的真菌OTU種類。與連作(W)相比，各輪作模式S、MT、T和R獨有的真菌OTU數目均有減少(圖1)。說明不同的輪作模式能引起土壤真菌菌群特異性變化，但特異的物種因輪作模式不同而有差異。其中W模式土壤中特異菌有厚垣輪枝孢菌(Metacordyceps)、多孢囊霉屬(Diversispora)、珊瑚菌屬(Clavaria)、擬青霉屬(Paecilomyces)、Conlarium、Cristinia和Remersonia；S模式特異菌有殼針孢屬(Septoria)、小叢殼屬(Glomerella)、Amaurodon、維羅納霉屬(Veronaea)和叉絲單囊殼屬(Podosphaera)；MT模式土壤中特異菌有殼多胞菌屬(Stagonospora)、雙型囊霉屬(Ambispora)、枹蕈屬(Peniophora)、Calcarisporiella和Monosporascus；T模式特異菌有粉褶菌屬(Entoloma)、Basidioascus、布爾喀霉屬(Burgoa)、Volvopluteus和光柄菇屬(Pluteus)；R模式特異菌有Toxicocladosporium、地星屬(Geastrum)、Paurocotylis、Mastigobasidium和傘菌屬(Bolbitius)。

2.6 不同輪作模式下土壤中小麥赤霉菌相對豐度

本試驗檢測了引起小麥赤霉病的病原菌(Gibberellazeae)在土壤中的含量，結果顯示，該病原菌的分布在5種種植模式間存在差異，其中T模式中豐度最高(0.66%)，與其他模式相比差異顯著(P<0.05)；W模式次之(0.06%)；在S模式中為0.05%；在MT和R模式中豐度很低，分別為0.03%和0.01%(圖7)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters meant significant difference at 0.05 level.

2.7 不同輪作模式下土壤真菌群落結構相似性聚類分析

對5種不同種植模式土壤真菌群落結構相似性進行聚類分析，結果顯示，真菌群落分為3組(圖8)。W單獨成為一組，T與MT模式真菌群落聚集在組1中，S與R模式聚集在組2中。表明，T與MT模式以及S與R模式的群落結構相似性更高。

圖8 不同輪作模式土壤真菌群落結構相似性聚類分析Fig.8 Cluster analysis of soil fungal community structure under different rotation patterns.

3 結論與討論

土壤真菌是土壤微生物的主要組成部分，在土壤物質的分解、養分循環與能量流動過程中扮演重要的角色[18-20]，土壤中除了有益真菌，還有一部分是侵染作物、引起作物病害的有害真菌。土壤中真菌群落結構的多樣性影響作物的健康生長，通過耕作模式的改變，能夠改善土壤中微生物群落多樣性。其中輪作是一種重要的耕作模式。輪作可以增加作物多樣性、提高土壤生產力，而且可以改善土壤環境使病原真菌失去適宜的寄生條件，從而防止病原真菌滋生蔓延[21-22]。但不同的輪作模式對土壤真菌群落組成的影響不同。

研究不同植物與小麥輪作模式下土壤真菌群落組成、多樣性及特異真菌的分布特征，可進一步了解有益或致病真菌與植物宿主的關系[23]。從真菌群落組成和功能角度闡釋不同作物的輪作模式抑制小麥赤霉病或隔斷病害傳播的微生物學機理，從而為篩選較為合理的輪作模式提供理論依據。

3.1 不同輪作模式土壤真菌多樣性特征

土壤真菌群落與土壤環境之間的相互關系可以用多樣性指數反映，不同的作物輪作模式對土壤環境產生的影響不同，菌群豐富度和多樣性也存在差異[24-25]。有研究表明，土壤養分含量與微生物數量之間存在正相關關系，微生物具有較高分解腐殖質能力，促使土壤物質更好地循環，土壤養分高，微生物多樣性也就高[26]。本研究中，MT模式提高了土壤真菌群落的多樣性，R模式土壤真菌群落的豐富度最高，輪作模式S土壤真菌的豐富度與連作相比也有提高。有研究表明，油菜等十字花科植物的根系可以分泌有助溶解和轉化土壤中難溶性磷的有機酸，提高土壤速效磷含量，促進微生物的代謝活動，增加微生物數量和提高群落微生物多樣性[27]。

3.2 不同輪作模式土壤真菌類群組成

合理輪作不僅能豐富有益真菌的種類、減少土壤里有害真菌的數量，而且還能改變土壤中微生物群落結構[28]。土壤微生物在抑制土傳病害和誘導植物抗性中起著重要的作用[29]。本研究中，各模式土壤共同的優勢菌門為子囊菌門、接合菌門、擔子菌門、壺菌門、球囊菌門、油壺菌門和蟲霉門，但各菌門的豐度大小在不同模式間存在差異。本研究中，子囊菌門為5種模式共有的優勢菌群，相對豐度在65.15%～85.29%，這一結果與前人研究結果一致[30-32]。有研究表明，子囊菌門是土壤中主要的分解者，能夠分解環境中的木質素和角質素等難降解的有機質[33-35]。子囊菌在各優勢屬中仍然占主導，其中柄孢殼屬、織球殼屬、假裸囊菌屬和毛殼屬在5種模式中均為優勢屬，但豐度大小不同。接合菌門在各處理中的豐度僅次于子囊菌門，其中貢獻最大的是被孢霉屬，豐度為4.68%～22.17%。研究發現，長孢被孢霉可以防止土壤退化，改善土壤，并促進植物生長素的產生[36]。另外，4種輪作模式較連作土壤中擔子菌門真菌豐度增加。研究發現，有些擔子菌可與植物形成菌根，有利于作物生長。

病害發生的原因主要是某一類病原菌在土壤微生物群落中成為優勢菌群，增加了植物的發病概率。水飛薊、甜菜、油菜與小麥輪作的土壤中小麥赤霉菌較小麥連作土壤豐度降低，說明適宜的輪作模式可以降低小麥赤霉病菌群的富集。作物通過不同輪作方式，能使病原微生物失去原寄主，從而減輕病害的發生。作物連作增加了病原菌的富集。然而不同的輪作作物產生的效應不同。本研究中，小麥與馬鈴薯輪作模式，小麥赤霉病菌顯著增加，這與田間對赤霉病的發病情況調查結果一致。而且OTU值也是幾種種植模式中最低的，反映出該輪作模式容易使優勢病原菌積累，而且微生物多樣性不僅沒有增加反而較連作有所降低。

3.3 不同輪作模式土壤真菌特異性

微生物與植物之間互相選擇，互相影響。不同作物的土壤中有著各自特異的微生物種群[37]。研究發現，土壤中微生物菌群內特異種群數量越多，土壤生態環境越不穩定[38]。本研究中，W處理中特異菌分布最多，表明其土壤條件穩定性最差；W模式中特異菌有Remersonia、Conlarium和擬青霉屬等。研究發現Remersonia在高發鐮刀菌枯萎病(Fusdrzumoxysporum)土壤的微生物群落中具有重要作用[39]。Conlarium是深色有隔內生真菌(Dark septate endophytes，DSE)，DSE具有類似菌根的生態學功能。有研究發現DSE類群中的一些種對枯萎病具優良生防作用[40]。在4種輪作模式中，發現均存在一些特異的有益真菌。MT模式土壤中特異菌雙型囊霉屬是一種叢枝菌根真菌。王啟[41]在研究草原百合科植物菌根真菌時發現雙型囊霉屬真菌可在蔥屬植物根系內共生；另外，還有枹蕈屬，可產生植酸酶。有研究發現一些枹蕈屬產生的植酸酶對土壤中添加的六磷酸肌醇和內源有機磷有很好的水解效果[42]。R模式發現的一種特異菌Paurocotylis是一種叢枝菌根真菌。

3.4 土壤真菌群落結構相似性分析

土壤真菌群落結構受地上種植作物的影響，群落相似性聚類分析結果表明，S與R，T與MT土壤真菌群落結構相似，W模式與各輪作模式差異較大。小麥—小麥—甜菜、小麥—小麥—油菜輪作中，輪作作物種植周期、土壤耕作方式相同、對土壤資源的利用方式相似，對真菌群落結構的改變作用相同。小麥—小麥—馬鈴薯、小麥—小麥—水飛薊輪作中，輪作作物對土壤性質、生態特性要求一致，所以土壤菌群結構較相似。小麥連作與其他輪作作物相比對土壤資源的利用方式、對土壤性質要求不同，因此真菌群落結構差異較大。

本研究詳細分析了油菜、馬鈴薯、甜菜和水飛薊與小麥輪作及小麥連作模式中真菌群落的豐富度、多樣性和組成的變化，以及小麥赤霉菌豐度的變化。油菜和甜菜與小麥輪作增加了土壤真菌的豐富度，水飛薊與小麥輪作提高了土壤真菌群落的多樣性。油菜、甜菜和水飛薊與小麥輪作模式中，小麥赤霉菌的相對豐度均有所下降，另外其他有益菌群明顯富集，例如Ambispora、Peniophora和Paurocotylis等。近年來，額爾古納市不斷優化農業種植結構，持續提高經濟作物種植面積，主要種植小麥和油菜，大力發展水飛薊、甜菜和莜麥等特色產業。因此，根據本研究結果建議選擇油菜、水飛薊和甜菜作為與小麥輪作作物，以減輕小麥赤霉病的危害。