杜梨PbGID1家族基因克隆、CRISPR/Cas9載體構建及遺傳轉化

宋平麗，李 剛，許建鋒，馬青翠，亓寶秀，2，張玉星

(1.河北農業大學 園藝學院，河北 保定 071000；2.利物浦約翰摩爾斯大學，利物浦 L3 3AF)

赤霉素(Gibberellin，GA)是植物生長發育過程中起重要作用的一種植物激素。GA信號的轉導過程主要是通過形成GA-GID1(Gibberellin insensitive dwarf 1)復合體后再與DELLA結合，誘導DELLA被泛素化降解，從而解除DELLA的阻遏作用，引起下游基因的表達，導致GA反應[1]。其中赤霉素受體GID1是赤霉素信號轉導途徑中與赤霉素特異性結合的關鍵蛋白，是植物感知赤霉素信號所必需的受體蛋白，對GA信號轉導起重要作用[2]。

2005年GID1基因首次在水稻GA不敏感的矮化突變體gid1中被鑒定出來[2]。2006年，研究人員在擬南芥基因組中鑒定出3個水稻GID1的同源基因，分別是AtGID1a、AtGID1b和AtGID1c，單基因突變均不會引起矮化表型，但是三突卻表現出GA不敏感的極矮化表型，證明它們功能冗余[3-4]。Hollender等[5]發現，桃樹(Prunuspersica)發育遲緩性侏儒癥(Brachytic dwarfism trait)是由于赤霉素受體PpeGID1c無義突變造成的，且改變GID1c的表達可以在不影響果實發育的情況下控制樹體大小。隨著生物技術的不斷發展，赤霉素受體GID1基因已相繼從楊樹[6]、棉花[7]、茶樹[8]、甘藍型油菜[9]、板栗[10]、葡萄[11]等物種中成功分離和表達。

CRISPR/Cas9 技術自2013年被發現以來，迅速被國際生物界關注并應用，已經成為基因組定點編輯的首選方法。目前，在園藝植物上也獲得了一些成功案例[12]。Illouz-Eliaz等[13]針對番茄中存在的3個GID1，通過CRISPR/Cas9技術構建了單突、雙突和三突，發現在適宜生長條件下，只有三突(gid1TRI)長勢弱小，葉色黑綠，而單突卻沒有明顯的表型，證明3個GA受體在適宜條件下功能冗余。以上研究也為CRISPR編輯技術在其他植物進行GID1基因編輯提供了重要參考。

杜梨以其抗性強，適應性廣，與梨品種嫁接親和力強等優點，成為我國北方應用最為廣泛的砧木[14]。由于其生長勢強，嫁接品種后樹體高大，給梨樹矮化密植栽培帶來較大的困難。本研究以杜梨為試材，通過克隆PbGID1家族基因，分析其氨基酸序列，設計相關突變關鍵靶位點，構建一套可同時編輯PbGID1家族基因的CRISPR/Cas9載體，轉化至杜梨子葉并再生出陽性植株，旨在為將來獲得矮化杜梨砧木提供理論和技術參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用杜梨葉片取自河北農業大學梨工程技術研究中心杜梨資源圃，液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存。

試劑及菌株：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase高保真DNA聚合酶和T4DNA連接酶訂購于TaKaRa公司，BsaⅠ-HF購自New England Biolabs(NEB)公司，大腸桿菌感受態細胞DH5α和pEASY-Blunt Zero Cloning Kit克隆載體購自北京全式金生物，KOD-Plus高保真酶訂購于東洋紡生物科技有限公司，DNA純化和膠回收試劑盒、引物合成和其他試劑均訂購于上海生工生物工程技術服務公司。植物表達載體pYLCRISPR/Cas9P35S-N和CRISPR/Cas9中間載體pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29均由華南農業大學劉耀光教授課題組提供[15]。農桿菌感受態EHA105為河北農業大學梨工程技術研究中心保存。

1.2 杜梨總RNA提取、cDNA合成和基因組DNA提取

杜梨總RNA提取參照TIANGEN RNA prep Pure Plant Kit提供的方法(天根生化科技有限公司)；cDNA合成參照TIANGEN FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒提供的方法(天根生化科技有限公司)；gDNA采用M5 HiPer Plus多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒提取(北京聚合美生物科技有限公司)。

1.3 基因結構及氨基酸序列分析

根據杜梨測序基因組數據庫數據，利用擬南芥AtGID1基因序列進行同源搜索，針對搜索的序列設計相關克隆引物(表1)。分別以杜梨cDNA和gDNA為模板擴增PbGID1家族基因。擴增程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 延伸 2 min。PCR產物進行膠回收后，連接至pEASY-Blunt Zero Cloning Kit克隆載體，轉化大腸桿菌感受態DH5α中，挑取單克隆測序。

利用GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn)在線軟件[16]，對測序的cDNA序列和基因組DNA序列構建基因結構；采用ClustalW 2(https：// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行多序列比對，并利用 GeneDoc軟件對序列比對結果進行編輯并輸出。

1.4 CRISPR/Cas9靶點設計及載體構建

根據克隆的杜梨PbGID1s基因序列，使用CRISPR-P v2.0(crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2.0/)在線軟件尋找潛在靶位點。靶點序列應位于基因外顯子區域且不跨越內含子；靶點序列盡量不要包含4個及以上連續的胸腺嘧啶T；根據靶點GC含量和位置選擇潛在靶點，最終確定8個靶點T1～T8。

根據唐雨薇等[17]報道的方法進行載體構建，載體系統包含雙元植物表達載體pYLCRISPR/Cas9P35S-N和針對8個靶點的sgRNA表達盒中間載體pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1和pYLgRNA-AtU6-29。引物參照表2合成，共需要進行2輪PCR，第1輪PCR針對每一個靶點進行2個獨立的反應，T1～T8的2個反應依次為：U-F/AtU3dT1(反應①)和gRT1/gR-R(反應②)；U-F/AtU3bT2(反應①)和gRT2/gR-R(反應②)；U-F/AtU6-1T3(反應①)和gRT3/gR-R(反應②)；U-F/AtU6-29T4(反應①)和gRT4/gR-R(反應②)；U-F/AtU3bT5(反應①)和gRT5/gR-R(反應②)；U-F/AtU6-1T6(反應①)和gRT6/gR-R(反應②)；U-F/AtU6-29T7(反應①)和gRT7/gR-R(反應②)；U-F/AtU3dT8(反應①)和gRT8/gR-R(反應②)；第2輪PCR取第1輪反應①和②的PCR產物混合為模板，用Pps-GGL/Pgs-GG2、Pps-GG2/Pgs-GG3、Pps-GG3/Pgs-GG4、Pps-GG4/Pgs-GG5、Pps-GG5/Pgs-GG6、Pps-GG6/Pgs-GG7、Pps-GG7/Pgs-GG8、Pps-GG8/Pgs-GGL擴增，PCR產物純化回收，即獲得相應的T1-gRNA至T8-sgRNA表達盒片段。

將雙元載體pYLCRISPR/Cas9P35S-N質粒與8個sgRNA表達盒回收片段，按表3提供的試劑比例添加，采用酶切-連接方法進行構建，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α，以卡那霉素(Kanamycin，Kan)篩選陽性菌落，并挑取單克隆，利用SP-L2/SP-R-C特異引物檢測目標條帶大小，菌液測序后提取質粒并轉化農桿菌EHA105備用。

表2 CRISPR/Cas9-PbGID1s 載體構建所需引物Tab.2 Primers for CRISPR/Cas9-PbGID1s vector construction

表3 表達載體構建體系Tab.3 Expression vector construction system

1.5 杜梨子葉浸染及遺傳轉化

杜梨子葉再生參照林靜[18]的方法，遺傳轉化參照龐宏光[19]的方法，主要操作包括：杜梨種子消毒、子葉誘導愈傷培養、農桿菌介導的遺傳轉化、篩選培養基培養4個步驟。

陽性植株檢測：將在篩選培養基上生長的抗性芽及對照正常培養40 d后，對抗性苗和對照植株進行編號，提取基因組DNA，根據表達載體序列設計特異引物VecF/VecR(表4)，凝膠成像后根據條帶大小判斷抗性苗是否為轉基因陽性苗。

2 結果與分析

2.1 杜梨PbGID1s基因克隆

以杜梨cDNA和基因組DNA為底物進行PbGID1s的克隆，利用特異引物(表1)，克隆到杜梨PbGID1家族的4個成員，分別命名為PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1和PbGID1c-2，如圖1所示，PbGID1b-1、PbGID1b-2，PbGID1c-1和PbGID1c-2的CDS序列分別為1 041，1 041，1 095，1 035 bp，DNA全長分別為1 401，1 373，1 706，1 640 bp。基因結構分析發現，PbGID1s家族成員均含有2個外顯和1個內含子(圖1-C)。

2.2 PbGID1s氨基酸序列分析

對4個杜梨PbGID1s氨基酸序列進行比對發現(圖2)，4個PbGID1蛋白中均存在激素敏感酯酶家族保守的HGG和GXSXG保守域。擬南芥AtGID1s蛋白序列包含13個與GA或 DELLA的結合區，N端至C端依次為TWVLIS、LDR、FFHGGSF、HS、IYD、YRR、DGW、GDSSGGNI、GNI、MF、LDGKYF、WYW和 GFY[20]，對PbGID1s的氨基酸序列分析發現，除PbGID1b-1蛋白LDR結構域中的D被E取代外，其他結合區序列一致。以上結果表明，杜梨4個PbGID1s蛋白均具有GID1家族特有的保守結構，且在GA信號轉導中發揮重要功能的氨基酸結構域與模式植物高度相似，屬于GID1家族成員。

表4 陽性植株檢測引物Tab.4 Primers for detection of positive plantlets and gene editing effect

A、B.分別以杜梨cDNA(A)和gDNA(B)為模板的PCR電泳圖。1.PbGID1c-1；2.PbGID1c-2；3.PbGID1b-1；4.PbGID1b-2。C.PbGID1s基因結構。A，B.Gel electrophoresis of PCR products amplified using cDNA(A)or gnomonic DNA(B)of Pyrus betulifolia as template.1.PbGID1c-1；2.PbGID1c-2；3.PbGID1b-1；4.PbGID1b-2.C.Gene structure of PbGID1s.

2.3 基因編輯打靶位點的設計

針對杜梨PbGID1家族的每個基因分別設計2～3個靶點，以此降低脫靶風險，且靶點位置應在保守結構域HGG、GXSXG或關鍵結合區域上游，使PbGID1s發生關鍵位點的缺失或突變，進而失去功能。PbGID1s靶點選擇如圖3所示，共設計8個靶點，其中靶點T2、T6靶向PbGID1c-1，T1靶向PbGID1c-2，T3靶向PbGID1c-1和PbGID1c-2；T7靶向PbGID1b-1，T4、T8靶向PbGID1b-2，T5靶向PbGID1b-1和PbGID1b-2。

2.4 sgRNA表達盒和PbGID1s基因編輯載體構建

sgRNA表達盒的構建采用2輪PCR的方法，第1輪PCR擴增結果如圖4-A所示，靶點T1/T8、T2/T5、T3/T6和T4/T7分別以pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1和pYLgRNA-AtU6-29為底物各進行2個反應，前后2段(前段用F表示，后段用R表示)PCR產物分別均為150/130 bp，400/130 bp，350/130 bp，370/130 bp左右。

右側數字表示氨基酸位置。HSL家族的HGG和GXSXG保守域由星號標出；橫線區域為GA或DELLA蛋白的結合位點。The numbers in the right indicate positions of the amino acid sequences of cDNA.The HGG and GXSXG conserved domains of the HSL family are marked by asterisks；the underlined regions are the binding sites for GA or DELLA proteins.

紅色NGG代表PAM序列。NGG highlighted in red are PAMs.

第2輪PCR將含有靶點序列的2個PCR產物混合后共同作為底物，使2個片段疊加成一個表達盒，擴增結果如圖4-B所示，其中攜帶T1、T2/T5、T3/T6、T4/T7和T8靶點序列的表達盒片段分別依次為288，532，488，503，289 bp，通過電泳檢查8段產物大小均符合預期，測序后證明sgRNA表達盒構建成功。

將8個sgRNA表達盒按表4體系構建至載體后，通過對陽性單克隆的菌液測序發現在pYLCRISPR/Cas9P35S-N載體中包含數目不等的靶點序列，其中最多包含5個靶點，分別是T1、T5、T6、T7、T8(圖4-C)，目標靶點與啟動子在載體連接順序為AtU3d+T1-AtU3b+T5-AtU6-1+T6-AtU6-29+T7-AtU3d+T8。該序列位于pYLCRISPR/Cas9P35S-N載體2個BsaⅠ酶切位點之間，以上結果證明成功將帶有5個靶點的sgRNA表達盒構入CRISPR/Cas9載體序列當中，且能同時靶向PbGID1家族的4個基因。

A.第1輪PCR跑膠圖；B.第2輪PCR跑膠圖；C.重組質粒示意圖。A.First round PCR electropherogram；B.Second round PCR electropherogram；C.Schematic diagram of plasmid recombination.

2.5 杜梨子葉遺傳轉化

將上述成功構入5個靶點的CRISPR/Cas9載體轉化入農桿菌EHA105中用于浸染杜梨子葉，試驗重復3次，分別對浸染子葉數目、抗性子葉數目、抗性芽數目、陽性苗數目進行統計，統計結果如表5所示：第1次試驗共浸染杜梨子葉195粒，具有抗性芽的子葉為32粒，占總數的16.41%，每粒子葉再生抗性芽數目為2.01，陽性苗為10株；第2次試驗共浸染杜梨子葉200粒，具有抗性芽的子葉為21粒，占總數的10.50%，每粒子葉再生抗性芽數目為2，陽性苗為8株；第3次試驗浸染杜梨子葉200粒，具有抗性芽的子葉為33粒，占總數的16.50%，每粒子葉再生抗性芽數目為2.15，陽性苗15株。3次試驗共計浸染595粒杜梨子葉，獲得抗性芽176個，陽性植株33株，轉化效率達到5.55%。對第2次試驗結果中的抗性苗及對照苗提取基因組gDNA，用載體特異序列VecF和VecR(表4)為引物擴增，部分結果如圖5所示，空載體序列(22)為1 750 bp左右；共篩選出8株陽性苗分別編號3、6、7、11、12、15、20、23，因將sgRNA表達盒構建入載體，使得PCR擴增片段為3 000 bp左右，以上結果證明該CRISPR/Cas9表達載體已成功轉入杜梨基因組。

表5 杜梨遺傳轉化結果Tab.5 Genetic transformation result analysis of Pyrus betulifolia

1～21，23.部分轉化植株；22.陽性對照(空載體)；24.未轉化植株。1—21，23.Partially transformed plantlets；22.Positive control(empty vector)；24.Untransformed negative control plantlet.

3 結論與討論

赤霉素受體蛋白GID1在GA信號轉導途徑中起重要作用，負調控因子DELLA蛋白阻遏GA信號，而GA-GID1-DELLA復合體的形成是阻遏蛋白DELLA被降解的前提[21]，并且該復合體的形成也會一定程度降低植物體內游走的DELLA蛋白含量，從而降低DELLA蛋白對植物生長的抑制作用[22]。Cheng等[23]發現，壽星桃作為一種對GA處理不敏感的矮化突變體就是因為PpGID1c的第191位氨基酸發生突變，導致其不能與DELLA發生互作引起的矮化。因此GID1功能喪失或改變，使其不能形成復合體，可能會抑制或阻遏GA信號轉導途徑，使植株出現對GA不敏感的矮生表型。本研究利用同源克隆方法克隆得到4個杜梨GID1家族基因，通過序列比對及保守結構分析推測該家族基因均符合GID1蛋白特征，可能對杜梨GA信號轉導起重要作用。

CRISPR/Cas9 作為一種由sgRNA介導的基因編輯技術，能在全基因組水平有選擇性地調控目的基因表達，通過特異性識別具有PAM序列的目標DNA序列，對特定的靶點進行高效編輯；CRISPR/Cas9可以同時對任意數量基因進行編輯，因其具有高效、精準和便捷等特點，已經逐漸發展成為研究基因功能及物種定向改造的常用工具。但是，受限于遺傳轉化體系的不成熟，在木本植物尤其是在梨樹上的應用仍存在很大困難。杜梨作為實生砧木在梨樹生產中具有重要作用，但是以杜梨為砧木的嫁接品種生長后期往往樹體高大，不利于矮化密植栽培的應用。所以通過利用CRISPR基因編輯技術定向突變杜梨PbGID1s基因，使其獲得矮生性狀成為可能。目前，楊鋒等[24]已經通過構建雙靶點的CRISPR/Cas9基因編輯載體，并利用農桿菌介導的遺傳轉化法，將GUS轉基因紅茄梨愈傷組織的GUS基因敲除。Pang等[25]利用CRISPR/Cas9編輯技術，通過農桿菌介導轉化的方法敲除杜梨PbPAT14基因。本研究在以上研究結果的基礎上，構建了含有5個靶點的CRISPR/Cas9編輯載體，并成功利用農桿菌介導的方式將該載體轉入杜梨基因組，為杜梨遺傳轉化提供方法支持。

盡管經過多次嘗試和改良，本研究中心將該表達載體成功轉入杜梨子葉并獲得陽性植株。但遺憾的是，通過對陽性植株PbGID1s基因靶點前后約200～300 bp區域克隆并測序發現陽性植株均未發生編輯事件。究其原因，可能與本研究選用載體的啟動子非杜梨內源啟動子而是擬南芥特異啟動子有關。Charrier等[26]在蘋果中，利用蘋果內源啟動子U3和U6改造的CRISPR載體編輯效率顯著提高；Ren等[27]通過在葡萄中克隆本源啟動子VvU3/U6啟動sgRNA和UBQ2啟動子啟動Cas9蛋白后，也顯著提高CRISPR/Cas9載體在葡萄中的編輯效率。所以針對以上問題，接下來河北省梨工程技術研究中心將圍繞杜梨本源啟動子改造CRISPR/Cas9載體進行研究，在完善遺傳轉化體系的基礎上，為獲得杜梨矮生資源提供保障。

本研究克隆了4個杜梨PbGID1基因家族成員，PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1和PbGID1c-2，均由2個外顯子和1個內含子組成，且PbGID1s的氨基酸序列均含有HGG和GXSXG特征保守結構域和能與GA、DELLA結合的關鍵序列，具有赤霉素受體功能；成功將含有5個靶點的sgRNA表達盒構建至CRISPR/Cas9基因編輯載體，并可同時靶向PbGID1家族的4個基因；利用農桿菌EHA105介導，將CRISPR/Cas9-PbGID1s基因編輯載體轉入杜梨子葉，成功再生出陽性植株。