大豆GmRPK2基因的克隆及功能初步鑒定

顧啞慧，張常青，張雪冰，張鑫月，張鑫杰，葛榮朝

(河北師范大學 生命科學學院，河北 石家莊 050024)

植物生長發育過程中會遇到各種環境的脅迫，其中外環境因素主要有水、溫度、光照等，植物激素則是主要的內環境因素，如ABA、生長素、細胞分裂素、乙烯、GA、茉莉酸和油菜素內酯等。植物對于這些環境因素變化做出適當的反應，是其正常生長發育的必要條件[1]。

植物在受到非生物脅迫后，往往會激發自身細胞中的精密信號傳導網絡，調控相應基因的表達，以應對脅迫帶來的細胞生理變化。類受體激酶(Receptor-like protein kinases，RLKs)就是這個精密網絡中的一類能夠感知環境信號、放大信號傳遞，使細胞對逆境做出應答的蛋白激酶[2]。類受體蛋白激酶是結構類似于動物體內受體蛋白激酶的一類從植物中發現的激酶[3]。植物類受體蛋白激酶基因種類繁多，其中擬南芥中有大約610個，約占擬南芥所有蛋白質編碼基因的2.5%[2]。類受體激酶一般包括胞外受體結構域(Extracellular ligand binding domain，ECLB)、跨膜結構域(Transmembrane domain，TM)和胞內激酶域(Protein kinase catalytic domain，PKC)3個結構域[4]。

根據其胞外域的結構不同，植物類受體蛋白激酶可以分為6個亞家族，本試驗選擇的大豆類受體激酶GmRPK2屬于富含亮氨酸重復序列的類受體蛋白激酶(Leucine-rich repeats，LRRs)[5-7]。LRRs在植物激酶中幾乎占到50%，在植物代謝、生長和發育中發揮重要作用[8-9]。水稻凝集素類受體蛋白激酶OsLPK1的突變體表現為白化，這表明該激酶可能與植物葉片的發育有關[10]。擬南芥LRR類受體激酶GSO1和GSO2對于擬南芥胚胎發育及氣孔分布起著重要作用[11]。擬南芥受體激酶CLV1則參與調控莖的生長和花的數量[12]。另外，LRR類受體激酶還參與水稻的產量和分枝調節、擬南芥蓮座葉和花的發育以及植物的器官程序性死亡調控[13-15]。

LRRs類受體激酶在植物抵御非生物脅迫應答方面也起著重要的作用[16-21]。Osakabe等[22-23]研究表明，在擬南芥生長發育的過程中，AtRPK1基因的表達量降低會導致植株對ABA的敏感性顯著降低。AtRPK1、OsRPK1利用RNA干涉降低表達量后，可明顯提高擬南芥、水稻對鹽脅迫的耐受性[24-25]。

大豆GmRPK2基因與AtRPK1有著高度的同源性，本研究擬對其抗逆功能進行初步研究，以探究GmRPK2過量表達后對植物高鹽、干旱等非生物脅迫耐受性的影響，為之后研究大豆抗逆新品系及培育奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)為Columbia型，大豆(Glycinemax)品種為冀豆22，大腸桿菌DH5α、根癌農桿菌GV3101、表達載體pCAMBIA1300和p2300-GFP由河北師范大學遺傳學實驗室保存。

1.2 載體構建與擬南芥轉化及篩選

利用大豆葉片提取總RNA，反轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板，采用高保真PrimeSTAR酶，利用基因特異引物FP： 5′-GTCTAGAGAACAAGGGTTTTGG

GTCTCAC-3′(酶切位點XbaⅠ)和RP： 5-′CGGTACC

CACACAAGGGGCTAGCATGATG-3′(酶切位點KpnⅠ)進行PCR擴增。擴增產物進行瓊脂糖電泳后，將GmRPK2電泳條帶進行切膠、回收純化并連接到pMD18-T載體，轉入大腸桿菌。測序準確后的質粒利用XbaⅠ、KpnⅠ進行酶切、回收，將GmRPK2連接到表達載體pCAMBIA1300。酶切鑒定后將p1300-35S-GmRPK2重組載體轉化到農桿菌GV3101中。

另外，利用pMD18-T-GmRPK2質粒作為PCR模板，用引物GFP-RP：5′-CGGTACCGAACAAGGGTTT

TGGGTCTCAC-3′(酶切位點XbaⅠ)和GFP-LP：5′-GTCTAGAGCATGATGGGGGTTGAAGTTGCTT-3′(酶切位點KpnⅠ)擴增得到不含終止密碼子的GmRPK2基因序列，構建p2300-GmRPK2-GFP載體，轉入農桿菌GV3101。

搖培含有p1300-35S-GmRPK2、p2300-GmRPK2-GFP載體的農桿菌，利用浸花法轉化擬南芥，潮霉素(25 mg/L)篩選獲得陽性苗，單株收獲種子繼續篩選，選取陽性苗占比為3/4的株系繼續培養，單株收種后篩選得到GmRPK2過表達擬南芥純合體。

1.3 GmRPK2過表達擬南芥對ABA、干旱和鹽脅迫的抗逆性檢測

選取野生型和3個GmRPK2過表達擬南芥純合體株系種子，利用70%酒精和次氯酸鈉進行消毒，分別點播到含有10% PEG、1.5 μmol/L ABA、125 mmol/L NaCl的MS固體培養基和對照MS培養基，4 ℃春化3 d，轉至22 ℃光照培養箱中培養，統計萌發率，試驗進行3次生物學重復。

同樣選擇3個GmRPK2過表達株系和野生型擬南芥種子，消毒后點播到MS固體培養基，4 ℃春化3 d，轉到22 ℃光照培養箱中豎直培養3 d，選擇長勢、根長一致的幼苗分別轉移至含有10% PEG、1.5 μmol/L ABA、125 mmol/L NaCl的MS固體培養基和對照MS培養基上，繼續豎直培養5 d，對根相對生長量進行測量與統計，試驗進行3次生物學重復。

另外，在MS固體培養基上鋪布3個過表達株系和野生型擬南芥種子，4 ℃春化3 d，恒溫光照培養箱培養10 d，幼苗轉移至營養土中，光照培養14 d。選取生長狀況一致的過表達株系和野生型植株，用175 mmol/L NaCl脅迫處理，每隔3 d澆一次鹽水，脅迫處理18 d，觀察其生長狀況。另外選取一批長勢一致的過表達株系和野生型植株，停止澆水，干旱處理14 d，觀察其生長狀況。

1.4 轉基因擬南芥的生理檢測

3個過表達株系和野生型擬南芥正常光照培養14 d后，取長勢一致的植株，停止澆水14 d作為干旱處理組，175 mmol/L NaCl溶液澆灌18 d作為鹽脅迫處理組，清水澆灌作為對照組。取葉片進行細胞質膜透性、丙二醛含量、葉綠素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量和離體葉片失水率等生理指標檢測。植物葉片中過氧化氫積累量觀察采用DAB組織染色法進行測定。

細胞質膜透性采用電導率法進行測定，每次取樣稱質量0.2 g擬南芥葉片，剪成適當小塊，向離心管加入10 mL蒸餾水將葉片盡可能壓入水中，真空抽氣1 h后，室溫攪動浸提1 h后，測定樣品電導率。然后100 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，測定各種樣品的煮沸電導率。

相對電導率=(處理電導率-空白電導率)/(煮沸電導率-空白電導率)×100%。

1.5 GmRPK2的表達對擬南芥抗逆信號通路相關基因的表達量影響

選取定位于植物抗逆相關信號通路下游基因SAD1、FRY1、SOS3、ESK1、RD29B、ADH1和P5CS1。設計相應引物，以β-Actin基因作為內參，對野生型擬南芥和GmRPK2過表達擬南芥植株進行熒光定量PCR檢測(表1)。

2 結果與分析

2.1 非生物脅迫對GmRPK2基因表達的影響

取正常培養14 d的大豆幼苗進行的120 mmol/LNaCl、1.5 μmol/L ABA、5% PEG脅迫0，1，6，12 h，取葉片進行qRT-PCR檢測。結果表明，GmRPK2在鹽脅迫1 hGmRPK2基因表達量明顯上升，而在6，12 h出現下降趨勢，PEG、ABA處理后GmRPK2基因表達量同樣也在1 h有所上升，隨后出現回落(圖1)。

表1 qRT-PCR引物堿基序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4—5，7—9同。Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).The same as Fig.4—5，7—9.

2.2 GmRPK2亞細胞定位觀察

構建得到p2300-GmRPK2-GFP質粒，以含有空載p2300-GFP質粒的農桿菌為對照組，含有p2300-GmRPK2-GFP質粒的農桿菌為試驗組，注射煙草葉片，36～48 h內觀察GmRPK2表達蛋白的亞細胞分布情況。其中注射空載質粒煙草葉細胞的細胞核及細胞膜中均可激發綠色熒光，但試驗組僅細胞膜具有綠色熒光蛋白，由此推測GmRPK2蛋白主要分布在細胞膜上(圖2)。

圖2 GmRPK2亞細胞定位Fig.2 Subcellular localization of GmRPK2 fusion protein

2.3 GmRPK2轉基因株系的分子水平鑒定

提取野生型和轉基因過表達擬南芥的基因組DNA，同時提取總RNA，反轉錄為cDNA。以DNA作為模板，利用FP和RP引物進行PCR擴增，篩選獲得成功轉入外源基因GmRPK2的3個轉基因株系OX1、OX2、OX3(圖3-A)。對其cDNA同樣利用FP和RP引物進行RT-PCR鑒定，確認GmRPK2基因在這3個擬南芥株系中均實現表達(圖3-B)。

A.基因組PCR檢測；B.RT-PCR檢測；M.DL2000 DNA Marker。A.PCR detection of genome；B.RT-PCR detection；M.DL2000 DNA Marker.

2.4 GmRPK2轉基因株系的抗逆性分析

2.4.1 轉基因種子萌發過程中的抗逆性檢測 對GmRPK2過表達擬南芥的3個純合體株系OX1、OX2、OX3和野生型擬南芥種子進行消毒處理，點播在含有ABA、PEG和NaCl的MS固體培養基及對照培養基上。萌發率檢測結果表明，對照培養基的3個過表達株系種子及野生型種子的萌發情況基本一致。在1.5 μmol/L ABA培養基上4 d后，野生型萌發率為85.56%，3個轉基因株系萌發率分別為12.22%，15.56%和14.44%；在125 mmol/L NaCl培養基上培養4 d后，野生型擬南芥萌發率為70.00%，而3個過表達株系萌發率分別僅為10.00%，11.11%和8.89%。在10% PEG培養基上4 d后，野生型萌發率為84.44%，3個轉基因的株系萌發率分別為21.11%，22.22%和22.4%(圖4)。

由此可見，GmRPK2過表達株系在ABA、NaCl和PEG脅迫下的萌發率均顯著低于野生型(P<0.05)，表現出對非生物脅迫更加敏感。

圖4 GmRPK2過表達擬南芥逆境脅迫下的萌發率檢測Fig.4 Germination rate of GmRPK2 overexpressed Arabidopsis under stress

2.4.2GmRPK2轉基因擬南芥幼苗根相對生長量的抗逆性檢測 對3個GmRPK2過表達株系OX1、OX2、OX3和野生型擬南芥種子消毒處理，在MS培養基上垂直培養3 d，挑選根長度一致的幼苗分別轉移到含有1.5 μmol/L ABA 、10% PEG和125 mmol/L NaCl的MS培養基。豎直培養5 d后，可發現在3種脅迫條件下，GmRPK2過表達擬南芥和野生型擬南芥的根生長都明顯受抑，過表達擬南芥根的生長受抑制更加明顯(圖5)。因此，對于各種非生物脅迫，GmRPK2過表達擬南芥較野生型在幼苗根的生長發育方面表現得更加敏感。

圖5 GmRPK2過表達擬南芥逆境脅迫下根的生長發育檢測Fig.5 Root growth and development of GmRPK2 overexpressed Arabidopsis under stress

2.4.3GmRPK2過表達擬南芥鹽脅迫及旱脅迫的抗逆性檢測 選取培養14～21 d、長勢狀況一致的GmRPK2過表達株系和野生型擬南芥植株，進行鹽、旱脅迫處理。鹽脅迫采用175 mmol/L NaCl溶液處理，每隔3 d澆灌一次。經過18 d處理，結果表明，在NaCl脅迫下，GmRPK2過表達擬南芥葉片枯萎的更加嚴重，莖稈萎蔫的更為厲害，幼嫩的莖尖部位嚴重萎蔫，抽薹高度也明顯縮短(圖6)。干旱處理14 d后，過表達擬南芥莖稈葉片明顯枯萎，側枝、果莢數量明顯減少，整體長勢較弱，而野生型植株整體長勢相對較好。由此可見，GmRPK2過表達使擬南芥成株對鹽、旱等非生物脅迫也表現出更加敏感的表型。

2.4.4GmRPK2過表達擬南芥鹽脅迫后的生理指標檢測GmRPK2過表達株系和野生型擬南芥正常培養14 d后，利用175 mmol/L NaCl處理18 d，檢測其葉片的葉綠素含量、丙二醛含量、過氧化氫積累和相對電導率等生理指標。試驗結果表明，在鹽脅迫后GmRPK2過表達植株的丙二醛含量顯著高于野生型，說明過表達植株所受細胞膜質過氧化的損傷程度更為嚴重(圖7-A)。過表達擬南芥的相對電導率相比野生型顯著增高(圖7-B)，表明過表達植株的脂膜透性顯著大于野生型，這可能導致更多有害離子滲入胞內，進而造成細胞受損更加嚴重。鹽脅

圖6 GmRPK2過表達擬南芥植株對高鹽和干旱的抗逆性Fig.6 Resistance of GmRPK2 overexpressed Arabidopsis adult plants to high-salt and drought

迫后過表達植株的葉綠素含量下降更為明顯，提示其光合系統受到的損害更為嚴重(圖7-C)。用DAB組織染色法對鹽脅迫前后葉片中過氧化氫積累情況進行觀察，結果顯示，過表達植株在鹽脅迫后其葉片出現更多的紅褐色斑點積累，提示其過氧化氫積累更多，葉片遭受的氧化脅迫更為嚴重(圖7-D)。

2.4.5GmRPK2過表達擬南芥旱脅迫后的生理指標檢測 野生型和GmRPK2過表達擬南芥株系OX1、OX2、OX3正常培養14 d后，取生長狀況一致的野生型和轉基因植株進行干旱處理，14 d后測定其葉片的脯氨酸和可溶性糖含量。結果表明，干旱脅迫后的過表達植株葉片的脯氨酸和可溶性糖含量均顯著低于野生型(圖8-A、B)。

分別剪取在苗室正常培養28 d的野生型和GmRPK2過表達擬南芥的葉片進行離體失水率測定，結果表明，GmRPK2轉基因植株葉片的失水率要大于野生型植株葉片的失水率，表明轉基因植物離體葉片的水分散失要大于野生型，這可能也是其對干旱脅迫更加敏感的原因之一(圖8-C)。

2.5 GmRPK2過量表達對下游基因的影響

為探究GmRPK2基因在擬南芥中過表達后造成其對鹽脅迫的耐受性下降原因，選取了位于CDPK、SOS、MAPK等3個信號通路下游的5個基因，以野生型擬南芥和GmRPK2過表達擬南芥的cDNA為模板進行RT-PCR檢測。結果表明，GmRPK2在擬南芥中的過表達顯著抑制了CDPK信號轉導通路下游的基因SAD1和脯氨酸合成相關基因P5CS1的表達。另外，GmRPK2的過表達也抑制了ABA信號轉導途徑ADH1基因的表達(圖9)。

圖7 鹽脅迫后GmRPK2過表達擬南芥的生理指標檢測Fig.7 Physiological index of GmRPK2 transgenic Arabidopsis under salt stress

3 結論與討論

植物類受體蛋白激酶(Receptor-like protein kinases，RLKs)在植物生長發育、應對生物脅迫及非生物脅迫中起到重要的作用。迄今，水稻中已經發現大量和抗逆相關的類受體激酶，例如水稻的Ca2+依賴蛋白激酶基因OsCDPK7過表達后，轉基因水稻對鹽脅迫和干旱脅迫表現出更強的耐受性，但耐冷性并未提高[26]。此外，水稻的類受體胞質激酶基因GUDK的表達量與干旱脅迫、鹽脅迫(200 mmol/L NaCl)、熱激(45 ℃)和冷激(4 ℃)等都表現出了不同程度的相關性[27]。GmRPK2基因和已知的抗逆相關基因AtRPK1、OsRPK1高度同源，本研究初步探究了GmRPK2基因對擬南芥耐旱性、耐鹽性的影響及其作用機理。

圖8 GmRPK2過表達擬南芥旱脅迫后的生理指標檢測Fig.8 Physiological indicators of GmRPK2 transgenic Arabidopsis under drought stress

圖9 GmRPK2過表達擬南芥中抗逆相關基因表達量的qRT-PCR檢測Fig.9 qRT-PCR of the expression of stress-related genes in GmRPK2 overexpressed Arabidopsis

基因表達模式研究表明，GmRPK2在鹽、干旱脅迫1 h時基因表達量明顯上升而后則出現下降趨勢。抗逆性檢測結果表明，在鹽脅迫、干旱脅迫和ABA處理下，GmRPK2過表達擬南芥在種子萌發期、幼苗生長階段和成株時期均表現出抗逆性下降。

植物受到非生物脅迫處理后，往往會產生大量活性氧(ROS)，進而引起氧化脅迫。植物體內過量的ROS會導致醛類物質的增多，從而破壞DNA、碳水化合物、脂膜及白質的結構。同時，過量的ROS也會造成質膜通透性增大，導致K+等電解質外滲[28]。植物對非生物脅迫的耐受性和低水平的ROS之間具有明顯的正相關[29]。本研究用DAB組織染色法對鹽脅迫前后擬南芥葉片中過氧化氫積累情況作了觀察，結果顯示，過表達植株葉片有顯著增多的紅褐色斑點積累，提示其過氧化氫的積累更多，葉片遭受的氧化脅迫更為嚴重。生理指標檢測表明，鹽處理后GmRPK2轉基因擬南芥的MDA含量和電導率均高于野生型擬南芥，葉綠素含量下降更為明顯，證明GmRPK2轉基因擬南芥受到更加嚴重的氧化損傷，細胞質膜的損傷更為明顯，這些可能都是GmRPK2轉基因擬南芥耐鹽性、耐旱性下降的內在生理原因。

另外，植物體的脯氨酸及可溶性糖是重要的滲透調節物質，植物在受到干旱等非生物脅迫時細胞內脯氨酸含量及可溶性糖含量會迅速增加，來維持細胞較高的滲透勢，從而減少水分的散失[30]。干旱處理后，GmRPK2過表達植株的脯氨酸含量以及可溶性糖含量顯著降低表明其在逆境下滲透調節能力要劣于野生型，這可能是其對干旱脅迫耐受性下降的原因之一。

已有研究表明，在擬南芥中存在一系列非生物脅迫信號的傳導通路，如SOS、MAPK、CDPK、ABA信號通路等。這些信號通路相關的常見基因包括SOS3、ESK1、FRY1、SAD1、RD29B、ADH1和P5CS1等[31-34]。通過對擬南芥抗逆信號轉導通路相關基因進行定量PCR，結果表明，SAD1、P5CS1、ADH13個基因的表達在GmRPK2過表達擬南芥中明顯受抑。其中，SAD1位于CDPK信號通路，因此，GmRPK2可能通過抑制CDPK抗逆信號通路影響轉基因植株的耐鹽性，GmRPK2基因可能位于SAD1的上游。P5CS1則與植物的脯氨酸合成密切相關，GmRPK2的過表達造成了轉基因擬南芥體內的脯氨酸合成受到抑制，從而導致轉基因植株對干旱脅迫更為敏感[31]。ADH1是普遍存在于植物細胞中的一種正常條件下保持本底表達，逆境時表達活性提高的誘導酶。ADH1參與了多種植物激素如乙烯及ABA的傳導途徑，因此，其表達量與植物逆境也是密切相關。GmRPK2的過量表達明顯抑制了ADH1的表達，這可能也是影響轉基因擬南芥抗逆性的原因之一。

總之，經過初步研究，探明GmRPK2的過表達會造成擬南芥對非生物脅迫抗逆性的顯著下降，初步揭示了這種抗逆性改變的內在生理機制和信號轉導通路。對于GmRPK2影響植物抗逆性的其他內在機理，還需進一步研究證實。