擬南芥液泡H+-ATP酶E1亞基基因AtTUF啟動子的克隆及表達分析

孫海麗，梁 靜，王文佳，丁位華，王妮娜，柳凱恒，李成偉

(1.河南科技學院 生命科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省糧食作物基因組編輯工程技術研究中心， 河南 新鄉(xiāng) 453003；3.河南省現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

液泡H+-ATP酶(Vacuolar-H+-ATPase，V-ATPase，VHA)是一種高度保守的多亞基旋轉酶，廣泛存在于所有真核細胞中，定位于液泡膜和細胞內(nèi)膜系統(tǒng)的其他隔間(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、囊泡及內(nèi)體等)中[1-2]，具有ATP水解驅(qū)動的質(zhì)子泵功能。VHA傳統(tǒng)上被認為是一種“管家”酶，可以建立用于二次活性轉運的電化學質(zhì)子梯度，并維持pH值穩(wěn)態(tài)[3]，在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、新陳代謝及應激反應等過程中起著關鍵作用[4-5]。該酶由親水的V1和疏水的V0共2個區(qū)域構成，其中，V1位于膜外胞質(zhì)區(qū)，呈球莖狀，由A～H 共8個亞基組成，主要負責ATP的水解；V0整合于膜中，由a、c、c′、c″、d和e共6個亞基組成，主要負責將質(zhì)子從細胞質(zhì)轉移至液泡，同時作為V1聚合和裝配的基點[6-7]。

VHA酶E亞基在植物進化過程中較為保守[8]，并在植物的生長發(fā)育過程及響應非生物脅迫中均發(fā)揮著重要的作用。Dabbous等[9]發(fā)現(xiàn)，鹽生植物香雪球VHA酶E1亞基基因LmVHA-E1的過表達可以提高擬南芥對鹽和滲透脅迫的耐受性。Zhu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，水稻VHA酶E1亞基(OsVHA-E1)主要定位于反面高爾基體網(wǎng)狀結構(Trans golgi network，TGN)和液泡中，參與了內(nèi)膜腔內(nèi)pH值穩(wěn)態(tài)以及高爾基體形態(tài)和TGN的維持。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)，小麥VHA酶E亞基定位于細胞質(zhì)中，該基因啟動子區(qū)含有響應非生物脅迫的順式作用元件，且該基因表達受干旱、脫落酸(Abscisic acid，ABA)、鹽、冷害及H2O2的誘導，將該基因在擬南芥中過表達后能增強植物對鹽類和甘露醇的耐受性。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，構樹根中VHA酶活性的升高與VHA酶E亞基轉錄本和蛋白質(zhì)水平的升高呈正相關，暗示E亞基在植物對鹽脅迫響應中發(fā)揮著重要作用。Zhao等[13]的結果表明，在擬南芥中過表達小麥VHA酶E亞基基因能夠在鹽脅迫下促進種子萌發(fā)、根系生長和成年植株生長。馮露等[14]研究表明，谷子VHA酶E亞基SiVHA-E基因能不同程度響應鹽和冷脅迫以及植物激素ABA、水楊酸(Salicylic acid，SA)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)等，且過表達SiVHA-E基因可以顯著提高植物的耐鹽性。擬南芥中有3個VHA酶E亞基，其中，E2是花粉特異性表達基因；E3主要在外圍組織中表達；E1是胚胎發(fā)育的主要亞型[15]，對胚胎的生長發(fā)育必不可少，缺乏E1亞基的胚胎發(fā)育不會超過球形胚階段且高爾基體異常堆疊[6，16]，該亞基編碼基因AtTUF(又被稱為TUFF、EMB2448、VHA-E1、VHAE1，基因號AT4G11150)的突變會導致胚胎死亡[15]，表明AtTUF基因在擬南芥種子發(fā)育過程中具有關鍵作用。Dettmer等[17]研究表明，擬南芥AtTUF蛋白定位于液泡膜上。雖然關于擬南芥AtTUF的功能及亞細胞定位都有了一定的研究，但是關于AtTUF基因啟動子及組織表達特性的研究目前還未見詳細報道。

為了研究AtTUF基因的組織表達模式及轉錄調(diào)控，克隆了擬南芥AtTUF基因的啟動子序列并對其進行了順式作用元件預測分析，構建了AtTUF啟動子的GUS融合表達載體pBI121-pAtTUF，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化篩選得到擬南芥轉基因植株，對其進行了GUS染色，并對該基因的組織表達模式進行了分析，旨在為深入分析AtTUF基因的調(diào)控模式及功能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 哥倫比亞(Columbia)野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子，由河南科技學院植物激素與化控研究室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ、高保真酶PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase、MiniBEST Plant RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)及TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ均購自TaKaRa公司；T4DNA連接酶購自NEB公司；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；GUS染液購自北京華越洋生物科技有限公司；(±)ABA、IAA購自Sigma公司；MeJA購自索萊寶公司；聚乙二醇(PEG 8000)購自Amresco公司。

1.1.3 載體與菌株 大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α及農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；表達載體pBI121由周口師范學院徐克東老師饋贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬南芥的種植與培養(yǎng) 將種子用0.5% NaClO消毒10 min，無菌水漂洗5次，播種于MS培養(yǎng)基，4 ℃放置3 d，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：21 ℃，光照強度為80 μmol/(m2· s)，晝夜光周期為16 h光照/8 h黑暗。培養(yǎng)10～14 d移入土中放于溫室培養(yǎng)，溫室培養(yǎng)條件：20～22 ℃，光照強度為120 μmol/(m2·s)，晝夜光照周期為16 h光照/8 h黑暗，每周澆水1～2次。

1.2.2 擬南芥基因組DNA的提取 采用SDS法從擬南芥葉片中提取基因組DNA。

1.2.3AtTUF基因啟動子的克隆 在TAIR網(wǎng)上下載AtTUF基因翻譯起始密碼子ATG上游2 000 bp的 5′端側翼序列作為參考。根據(jù)啟動子序列利用Primer Premier 5.0 設計特異性引物，在上下游引物的5′端分別加上Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位點及酶切位點前15個堿基的目的載體序列，以便于后續(xù)采用無縫克隆的方法將AtTUF啟動子構建于表達載體pBI121上。上游引物AtTUFpro-F序列：5′-GAC

CATGATTACGCCAAGCTTGGTAATGATGAGCCTTC

TTC-3′，下游引物AtTUFpro-R序列：5′-GGACTGAC

CACCCGGGGATCCTTTTACCGGGAAAATCGGCGGT

C-3′(下劃線標注的為載體序列和酶切位點，引物由武漢金開瑞生物公司合成)。PCR反應體系：5×GXL Buffer 5 μL，GXL酶 0.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，擬南芥DNA 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，ddH2O 14.5 μL。PCR擴增程序：98 ℃ 10 s；60 ℃ 15 s，68 ℃ 2 min 10 s，30個循環(huán)。

1.2.4AtTUF基因啟動子表達載體的構建 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收與預期分子質(zhì)量大小一致的目標條帶，用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切pBI121質(zhì)粒并回收載體片段，然后用重組酶連接pBI121載體片段與AtTUF啟動子片段，參照ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit說明書配制反應體系，37 ℃孵育30 min后迅速置于冰上5 min；將重組產(chǎn)物通過熱激法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，37 ℃培養(yǎng)過夜；通過菌落PCR和小量酶切鑒定出陽性克隆，并送至武漢金開瑞生物公司測序；將測序結果與AtTUF基因組序列比對，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pBI121-pAtTUF。

1.2.5AtTUF基因的啟動子序列分析 利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫 (http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http：//www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/)對克隆的AtTUF啟動子序列的順式作用元件進行在線預測分析。

1.2.6 表達載體的農(nóng)桿菌轉化 利用熱激法將構建正確的重組質(zhì)粒轉化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，將轉化液涂布于含50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平的YEB固體平板上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，通過農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定陽性菌落。

1.2.7 擬南芥植株的遺傳轉化與陽性苗篩選 采用花芽浸蘸法[18]轉化哥倫比亞野生型擬南芥。將轉基因的擬南芥植株培養(yǎng)至成熟，收取T0種子，將種子消毒后點播在含有50 μg/mL卡那霉素、40 μg/mL羧芐青霉素的MS平板上，春化3 d后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14 d，挑選平皿上能長出真葉與根且生長狀態(tài)良好的T1陽性幼苗移栽培養(yǎng)，提取葉片基因組DNA進行PCR鑒定。收取T1陽性株系種子播于含有卡那霉素的MS平板上，篩選單拷貝插入的T2幼苗，直至篩選出T3純合株系，用于后續(xù)試驗。

1.2.8AtTUF基因啟動子的表達模式分析 取培養(yǎng)7～14 d的T3植株幼苗，成苗植株的蓮座葉及側枝、莖生葉、莖、花序，不同時期的果莢及T3純合體種子萌發(fā)后的幼苗，浸入GUS染色液中，37 ℃避光染色；用70%乙醇脫色1 h，95%乙醇脫色(每隔2 h更換染液一次)至綠色褪去，用40%，20%，10%，5%乙醇各處理5 min，再用25%，50%甘油各處理15 min，用50%甘油壓片，于T視顯微鏡(AXIO Zoom.V16，Zeiss)下拍照。

1.2.9 激素與脅迫處理下AtTUF基因啟動子的表達分析 選取pBI121-pAtTUF轉基因純合株系種子，消毒后播種于含有卡那霉素的MS平板上，春化3 d、光照培養(yǎng)9 d后，取6株長勢一致的幼苗分別轉移至含有10 μmol/L(±)ABA、10 μmol/L IAA、50 μmol/L MeJA、200 mmol/L NaCl的MS平板上，光照或黑暗(用錫箔紙遮蓋)培養(yǎng)3 d后進行GUS染色；參考Verslues等[19]的方法進行PEG模擬干旱脅迫處理，將20% PEG 8000倒于無菌凝固的MS平板上，覆蓋平衡24 h后棄去PEG溶液，吹干后即為含有PEG的MS平板，取光照培養(yǎng)10 d的幼苗轉移至含PEG的MS平板上，光照培養(yǎng)2 d后染色。37 ℃染色1 h后脫色，拍照。

1.2.10AtTUF基因在不同組織中的表達檢測 取盛花期野生型植株的根、主莖、蓮座葉、花，發(fā)育期角果及成熟期的干種子，提取RNA，反轉錄成cDNA后，進行實時熒光定量PCR擴增，檢測AtTUF在不同組織中的表達水平。實時熒光定量PCR以ACTIN基因為內(nèi)參，引物序列為ACTIN-F： 5-′GGTAACATTGTGCTCA

GTGGTGG-3′，ACTIN-R：5′-AACGACCTTAATCTTCATGC

TGC-3′；AtTUF-F：5′-GCTGGTAAAGCAAAGGT-3′，AtTUF-R：5′-AATGCCACATCAAGACG-3′。反應體系為20 μL，反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算AtTUF基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 AtTUF啟動子的克隆

以野生型擬南芥基因組DNA為模板，利用引物對AtTUFpro-F/pro-R擴增AtTUF的啟動子片段，結果如圖1所示，條帶大小與預期目的基因條帶大小(2 000 bp)相符。將該條帶回收并純化，測序比對后發(fā)現(xiàn)，擴增片段與NCBI網(wǎng)站上提供的AtTUF基因ATG上游2 000 bp的啟動子序列一致，表明已成功克隆AtTUF的啟動子pAtTUF。

1.AtTUF啟動子擴增結果；M.DNA 標準。1.PCR products of AtTUF promoter；M.Marker.

2.2 pBI121-pAtTUF表達載體的構建

用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pBI121質(zhì)粒，結果如圖2-A所示，將pBI121質(zhì)粒上的啟動子片段切下，回收大片段。用無縫連接酶連接載體與pAtTUF片段，轉化DH5α，挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，結果顯示，1～5號均擴出了與預期大小相符的條帶(圖2-B)。挑取4號菌斑搖菌提取質(zhì)粒，并用Hind Ⅲ和BamHⅠ進行酶切鑒定，結果切出了一條約為2 000 bp的片段(圖2-C)，與預期大小相符。將該重組質(zhì)粒送公司測序，對測序結果進行比對，發(fā)現(xiàn)其與目的序列一致，表明表達載體pBI121-pAtTUF構建成功。將該質(zhì)粒轉化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，并通過菌落PCR驗證，挑取陽性菌斑搖菌備用。

A.pBI121的酶切結果：1.Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切pBI121的結果；M.DNA 標準。B.pBI121-pAtTUF重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落PCR鑒定：1—5.單菌落；M.DNA 標準；6.陽性對照(AtTUF啟動子PCR回收產(chǎn)物)；7.陰性對照。C.pBI121-pAtTUF重組質(zhì)粒的酶切鑒定：1.Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切pBI121-pAtTUF的結果；M.DNA 標準。

2.3 AtTUF啟動子順式作用元件分析

利用PlantCARE和PLACE網(wǎng)站對AtTUF基因翻譯起始密碼子ATG上游2 kb的側翼序列進行順式作用元件分析(圖3和表1)，結果表明，AtTUF啟動子中除了含有真核生物啟動子的基本元件CAAT-box和TATA-box外，還包含ABA響應元件ABRE、參與MeJA響應的順式作用元件CGTCA-motif、生長素響應元件TGA-element和AuxRR-core、參與干旱誘導的MYB結合位點 MBS、厭氧誘導必需的順式作用元件ARE、胚乳表達所需的順式作用元件GCN4-motif、分生組織表達相關順式作用調(diào)節(jié)元件CAT box及參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)的順式作用調(diào)節(jié)元件O2-site，同時，還包括光響應元件G-Box、G-box、Box Ⅱ、Ⅰ-box、TCT-motif、Box 4及AE-box。上述結果表明，AtTUF基因的表達可能受部分激素、逆境脅迫及光信號的調(diào)控。

圖3 擬南芥AtTUF 啟動子核心順式作用元件位點分析Fig.3 The sites analysis of key cis-acting elements in AtTUF promoter in Arabidopsis

表1 擬南芥AtTUF啟動子的主要順式作用元件Tab.1 Key cis-acting elements in AtTUF promoter in Arabidopsis

2.4 擬南芥轉基因陽性株系的篩選

采用農(nóng)桿菌介導的花芽浸蘸法，用含pBI121-pAtTUF的農(nóng)桿菌菌液對野生型擬南芥進行遺傳轉化，待轉基因擬南芥植株種子成熟后，收獲種子并將其播于含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選T1陽性苗，結果如圖4-A所示，轉基因陽性植株在含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上可以長出真葉及較長根系，而非轉基因幼苗只能長出子葉且葉片黃化、根系不能伸長。將陽性植株移栽，提取基因組DNA并進行PCR鑒定，由鑒定結果可知(圖4-B)，被檢測的T1轉基因擬南芥植株中均擴增出了801 bp的GUS標簽，而野生型植株中擴增不到目的條帶，表明所檢測的植株均為陽性植株。成熟后收獲T1植株種子，用卡那霉素篩選轉pBI121-pAtTUF的T2株系，挑選單拷貝插入(抗與不抗比例為3∶1)的株系繁種，并用卡那抗性篩選T3純合株系。

2.5 AtTUF基因啟動子組織表達模式分析

為了觀察AtTUF基因啟動子在植物生長發(fā)育過程中的組織表達模式，分別選取培養(yǎng)基上萌發(fā)7～14 d 的T3轉基因純合幼苗整株及盆栽6周植株的葉、莖、花、果莢及種子等進行GUS組織化學染色，結果顯示，在幼苗期，AtTUF基因啟動子驅(qū)動的GUS主要在子葉、真葉及根(圖5-A～D)中表達，在表皮毛(圖5-D)中也有較高表達，在胚軸中不表達；在成苗期，AtTUF基因驅(qū)動的GUS在蓮座葉(圖5-E)，表皮毛(圖5-F～G)，成熟的柱頭、花絲、花藥、花粉粒(圖5-H、J)，萼片(圖5-I)，幼嫩角果(圖5-L)中表達量均較高，在主莖(圖5-F)、花瓣(圖5-H、J)、發(fā)育期角果和種子(圖5-M～O)中有一定表達，在莖生葉及莖生葉側枝中(主要集中在表皮毛中表達)表達較弱(圖5-F、G)，在蓮座葉側枝的莖(圖5-K)、成熟期角果(圖5-P)及種子(圖5-P、Q)中未檢測到表達；在剛萌發(fā)幼苗的葉和胚軸中強烈表達，在根毛中有一定表達，在根尖區(qū)域表達較弱(圖5-R、S)。

1.表達載體pBI121-pAtTUF質(zhì)粒(正對照)；2—9.轉基因擬南芥植株；10.野生型擬南芥(負對照)；M.DNA標準。1.The plasmid of expression vector pBI121-pAtTUF (Positive control)；2—9.Transgenic Arabidopsis；10.Wild type Arabidopsis(Negative control)；M.Marker.

A～Q.T3純合體幼苗及成苗植株組織；R～S.T3種子萌發(fā)后。A.子葉期；B.四葉期；C.六葉期；D.七葉期；E.蓮座葉；F.主莖、莖生葉與莖生葉側枝；G.莖生葉側枝頂部葉片及花序(F紅色方框中放大圖)；H.主莖花序；I.萼片；J.單朵花；K.蓮座葉側枝；L.幼嫩角果；M.不同發(fā)育時期的角果及種子；N.果皮、假隔膜及未成熟種子；O.發(fā)育期種子(N紅色圓圈中放大圖)；P.成熟期角果；Q.成熟期種子；R.光照培養(yǎng)48 h的幼苗；S.光照培養(yǎng)60 h的幼苗。

2.6 AtTUF基因啟動子在激素與逆境脅迫處理下的表達模式分析

為了驗證AtTUF基因啟動子是否能夠響應植物激素及非生物脅迫信號，取pBI121-pAtTUF轉基因T3純合幼苗分別進行ABA、IAA、MeJA、NaCl、暗處理及PEG脅迫處理，并進行GUS化學染色，結果如圖6所示。除MeJA處理組中幼苗染色與對照(T3純合幼苗正常培養(yǎng))相比變化不明顯外，其他處理均使幼苗染色明顯變淡，表明ABA、IAA、鹽、暗處理及干旱脅迫均可抑制GUS基因的表達，暗示AtTUF基因啟動子對植物激素ABA與IAA及鹽、光、干旱等信號均有廣泛的響應能力。Hanitzsch等[1]研究發(fā)現(xiàn)，AtTUF基因表達受干旱脅迫的顯著抑制，這與本研究結果一致。

2.7 AtTUF基因表達特性分析

利用實時熒光定量PCR技術對盛花期(移苗后28 d左右)擬南芥的根、莖、蓮座葉、盛開的花，發(fā)育期的角果及剛成熟的干種子中AtTUF基因的表達量進行了測定，結果如圖7所示，該基因在發(fā)育期角果中的表達量最高，在花和干種子中次之，在葉中有一定表達，在根中的表達量最低。

3 結論與討論

啟動子是指基因編碼區(qū)上游的非編碼DNA區(qū)域，包含轉錄因子可以識別的特定序列，在植物基因表達和調(diào)控過程中起著重要作用[20-24]。對AtTUF啟動子區(qū)域的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，其啟動子區(qū)存在一些重要的轉錄調(diào)控元件，包含光反應元件MRE、G-box、Box Ⅱ、Ⅰ-box等，還包含與干旱誘導有關的MYB結合位點MBS，參與生長素反應的順式作用元件TGA-element及AuxRR-core，ABA響應順式作用元件ABRE和參與MeJA反應的順式作用調(diào)控元件等。其中，Ⅰ-box 和G-box可能是光合組織表達所必需的[20]，MBS和G-box是可將乙烯或脫落酸和脅迫整合到光周期反應的協(xié)調(diào)基序[25]。MYB元件和MYC元件對干旱和鹽脅迫均具有響應作用。ABRE元件一般被認為是參與ABA信號相關的順式作用元件，存在于許多抗逆基因的啟動子區(qū)域[26]，擬南芥中AtbZIP1基因可以與ABRE元件結合參與ABA依賴的信號傳導通路[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，AtTUF的啟動子活性受ABA、IAA、暗處理、鹽脅迫及PEG脅迫的抑制，這可能因為其啟動子區(qū)含有多種響應光、激素及非生物脅迫的元件所致，但AtTUF的啟動子活性不受MeJA的影響，這與Dettmer等[17]的研究結果相符。而Hanitzsch等[1]通過半定量試驗發(fā)現(xiàn)，AtTUF基因表達受鹽脅迫的輕微誘導，大約被上調(diào)10%，關于AtTUF基因表達是受鹽脅迫誘導還是抑制，尚有待通過實時定量試驗進一步驗證。

不同小寫字母表示AtTUF基因在不同組織中的表達量差異顯著(P<0.05)。The different lowercase letters indicate significant differences in the expression of AtTUF gene in different tissues at 0.05 level.

本研究構建了pBI121-pAtTUF的融合表達載體并轉化了擬南芥，對轉基因陽性植株的GUS染色表明，AtTUF啟動子在葉片(葉肉細胞及表皮毛)與幼嫩果莢中的表達量較高，在生殖系統(tǒng)(萼片、成熟花藥、花粉粒、柱頭)及發(fā)育早期的種子中也有較高的表達，在根和葉柄中也有一定的表達，這與Hanitzsch等[1]的研究結果一致，與擬南芥eFP網(wǎng)上預測的AtTUF基因表達模式基本一致。但是成熟的角果及其種子并未被染色，而定量結果卻顯示，AtTUF基因在剛成熟的干種子中也有一定表達，這可能是由于成熟角果及種子被干燥的果皮及種皮包裹而導致不易被染色。

研究表明，AtTUF基因?qū)τ谥参锏呐咛グl(fā)育至關重要[15，17]，但目前關于AtTUF基因的抗逆性及其調(diào)控機制的研究并不多。由于AtTUF啟動子區(qū)含有部分激素響應調(diào)控元件與脅迫相關反應元件，本研究對pBI121-pAtTUF轉基因擬南芥T3純合體幼苗進行ABA、IAA、MeJA、鹽、暗處理及PEG脅迫處理后初步發(fā)現(xiàn)，AtTUF啟動子活性受ABA、IAA、暗處理、鹽及PEG的抑制，表明AtTUF可能參與了對ABA與IAA信號及鹽、暗、干旱等非生物脅迫信號的響應，這仍需要進一步試驗驗證。在今后的研究中，還需對逆境脅迫處理后的AtTUF基因表達變化進行實時定量分析。

本研究克隆了擬南芥VHA酶E1亞基基因AtTUF的啟動子序列，分析了其順式作用元件，構建了由其驅(qū)動GUS的植物表達載體，進行了擬南芥的遺傳轉化，通過GUS染色及熒光定量PCR分析了該基因及其啟動子的組織表達模式。結果表明，AtTUF基因啟動子驅(qū)動的GUS在擬南芥幼苗期的葉片與根中、成苗期的葉片、萼片，成熟的柱頭、花藥、花粉粒及幼嫩角果中均有表達；且AtTUF啟動子區(qū)含有ABA、IAA等激素響應調(diào)控元件及干旱、厭氧等逆境脅迫相關的響應元件，暗示該基因可能參與了逆境信號響應。本研究結果有助于深入研究AtTUF基因在逆境脅迫中的功能及其表達調(diào)控規(guī)律。