中國南瓜×印度南瓜種間雜交自交系及組合的遺傳多樣性分析

宋 慧，古斌權，張香琴

(寧波市農業科學研究院 蔬菜研究所，寧波市瓜菜育種重點實驗室，浙江 寧波 315040)

利用表型和分子標記技術分析生物遺傳多樣性，是作物育種的重要環節[1-2]，是資源鑒定和品種親緣關系評價的重要手段[3-4]。方法成熟，報道較多[5-9]，主要開展自然群體關聯分析[10]、作物品種指紋圖譜構建[11]和地方種質資源多樣性分析[12-13]等研究。但這類報道多停留在為育種實踐提供理論依據的層面，對進一步通過引種、種間雜交或誘變等育種手段，拓寬作物遺傳多樣性的研究較少；進而利用表型和分子標記技術，比較和分析育種后代與現有資源的遺傳多樣性的報道就更少。

目前，市場暢銷的食用南瓜類型主要有中國南瓜的蜜本南瓜、香芋南瓜類型，印度南瓜的貝貝南瓜、板栗南瓜、貴族南瓜類型，以及美洲南瓜的長條筍瓜、圓形筍瓜和小菊瓜等。近年來，相同類型的南瓜品種，商品名稱更換很快，但是同質性很強[14]，推陳出新的后勁不足。有學者從南瓜商品種鑒定分類的角度，對各地搜集的商品種進行聚類分析，結果發現，中國南瓜、印度南瓜和美洲南瓜3個種之間的差異大，種內的遺傳相似度高[15]，相似系數為0.830～1.000[16-17]。地域來源相同的商品種通常會聚為一類[18-19]，但是張天明等[20]研究卻發現，由于當今種子市場繁榮，各地區相互引種育種，導致同質遺傳型品種再組合，品種(系)間遺傳多態性降低，地域差異趨同[14，16]。周琳等[21]曾利用SSR分子標記對路易斯安那鳶尾品種、雜交后代和誘變材料進行遺傳多樣性分析，結果表明，誘變材料與親本遺傳差異大。種間雜交也是拓寬南瓜遺傳多樣性的有效手段[22-25]。為此本研究院前期通過中國南瓜(Cucurbitamoschata)×印度南瓜(Cucurbitamaxima)種間遠緣雜交和胚胎拯救技術，獲得種間雜種[26]，并經過回交和多代自交，獲得耐熱的自交系[27]。現通過與骨干親本配制雜交組合，選育南瓜新品種。

為了進一步揭示種間雜種與現有南瓜商品種和核心親本具有明顯差別，本研究對目前市售的食用南瓜商品種、本研究院長期積累的骨干親本、以及中印南瓜種間雜交自交系及其新配組合，進行遺傳多樣性分析。系統評價現有食用南瓜品種和育種材料的親緣關系，明確中印南瓜種間雜種自交系及其新配組合的聚類地位，在表型和分子層面分析南瓜種間雜種拓寬南瓜遺傳背景的可能性。此外，有關南瓜植物學性狀調查的報道較多，從種子形態、果實形態以及植株長勢等多方面，調查指標多達70余項[28]。繁瑣的調查條目，不利于育種材料的高效調查與分析。為此，本研究擬利用主成分分析方法，解析30個表型性狀的主成分構成，簡化食用南瓜評價表型指標。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試材料53份，包括32份印度南瓜、5份中國南瓜和1份美洲南瓜，以及15份本研究院前期獲得的中印南瓜遠緣雜交自交系及自配雜交組合(表1)。其中商品種10份，農家種3份，骨干親本25份，自配組合15份。商品種涵蓋市場暢銷的各種食用南瓜，涉及中國南瓜的蜜本南瓜香芋南瓜類型，印度南瓜的貝貝南瓜、板栗南瓜、貴族南瓜類型，以及美洲南瓜的小菊瓜。試驗在寧波市農業科學研究院實驗基地和瓜菜育種重點實驗室進行。每份材料定植15株，采用隨機區組設計，重復3次，常規栽培管理。

表1 供試南瓜名稱、類型和部分表型性狀Tab.1 The name，type and partial morphological traits of pumpkins tested

表1(續)

1.2 試驗方法

1.2.1 植物學性狀調查 參照蔡寶炎[28]和褚盼盼[29]制定的南瓜植物學性狀調查表，結合本試驗制定南瓜形態學性狀調查內容和賦值標準(表2)。分別在植株伸蔓期、開花期、結果期和采收期，調查植株和果實的30個表型性狀。需要特別說明調查時期和記載標準的表型性狀見表3，其中，果實口感評價，按照尹玲等[30]報道的南瓜感官評價方法進行。

表3 部分南瓜形態學性狀調查時期和記載標準Tab.3 Investigation time and method of partial pumpkins morphological traits

1.2.2 遺傳多樣性分析 利用孔凡洲等[31]通過Excel建立的生物多樣性指數計算軟件，計算30個統計性狀的Berger-Parker指數(d)、Margalef指數(dMa)、和Shannon指數(He′)。其中Berger-Parker指數用來表示遺傳多樣性的優勢度，Margalef 指數用來表示豐富度，Shannon 指數用來測定群落多樣性的高低。3個指數數值越大，表明群體多樣性越豐富。

1.2.3 表型聚類和主成分分析 利用SPSS 19.0軟件[23]，采用聚類功能，各樣本間的距離用卡方距離進行度量，對30組表型數據進行聚類。利用SPSS 19.0軟件，對53份南瓜材料的30個統計性狀進行主成分分析，根據累計貢獻率≥85%原則，篩選主成分因子。在每個主成分因子中，30個統計性狀的特征向量排序不同，每個因子中特征性向量絕對值較大的1～2個性狀，是該主成分因子代表的主要特征。利用這些主成分因子對53份南瓜材料進行二次表型聚類分析。如果二次表型聚類與分子聚類具有較高符合度，則這些主成分因子可作為簡化表型性狀統計的指標。

1.2.4 SSR分子標記擴增與聚類圖繪制 在植株伸蔓期，取莖尖幼葉，液氮儲運。利用EasyPure?Plant Genomic DNA Kit試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)提取樣品DNA。利用K5600超微量分光光度計(北京凱奧科技發展公司)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量和濃度。參照Gong等[32]報道，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成南瓜SSR引物。選擇在前期南瓜SSR標記擴增試驗中，帶型清晰、多態性穩定的引物23對，進行標記擴增。

參照宋慧等[33]的報道，采用康為世紀生物科技有限公司2×Taq MasterMix(Day)PCR混合液，按照說明書調整反應體系為10 μL：5 μL 2×Taq MasterMix(Day)、0.4 μL 引物(10 mmol/L)、1 μL DNA(10 μg/μL)，加ddH2O至10 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，35個循環；72 ℃ 2 min。PCR產物使用5% Yeasen高分辨率瓊脂糖凝膠(上海翊圣生物科技有限公司)電泳。上樣量為1.1 μL，電壓90 V，電流100 mA，時間3 h。凝膠成像系統觀察擴增產物。

根據瓊脂糖凝膠電泳結果，統計條帶清晰、樣品間有多態性的位點，相同遷移位點擴增出條帶的記為“1”，無條帶記為“0”，建立0和1矩陣。計算標記多態信息量，多態性比例=(多態性位點/擴增位點)×100%。利用NTSYS-pc2.10e軟件處理數據，繪制聚類圖。

2 結果與分析

2.1 表型結果

2.1.1 南瓜形態學性狀的遺傳多樣性 圖1展示了3種南瓜測試組合30個形態學性狀的3個遺傳多樣性指數，結果顯示，3種南瓜組合分別為10個南瓜商品種、10個商品種+28份骨干親本以及10個商品種+28份骨干親本+15份中印南瓜雜交種后代。結果顯示，隨著育種材料的加入，供試南瓜的3個遺傳多樣性指數均增加。He′的增幅較小(均值2.09～3.72)，d和dMa的增幅明顯(均值6.84～31.42和2.77～9.92)。結果表明，供試10份南瓜商品種之間的表型已經存在不同之處，商品種的選擇具有代表性；骨干親本和中印南瓜雜交種后代的加入，在株型、生長勢和分枝分蘗等生長習性，以及果實皮色、果型等多方面使得商品種群體多態性豐富度提高。由于增加的材料均以選育食用南瓜為目標，因此，在果實口感、果肉厚度等方面的性狀與商品種育種目標一致，測試材料在這幾方面的多態性豐富度變化不大。

圖1 30個形態學性狀的3個遺傳多樣性指數在3種供試南瓜組合中的平均數的變化Fig.1 The changes of three genetic diversity index average value in three tested pumpkin combinations

2.1.2 53份南瓜材料表型聚類分析 采用SPSS軟件，根據30個形態學性狀在53份南瓜材料間的不同表現進行聚類，結果見圖2。在距離22的位置，將供試材料聚為三大類群。第一類包含20份南瓜材料，主要是中印南瓜遠緣雜交的親本及后代組合；第二類有30份南瓜材料，包含印度南瓜商品種及所有印度南瓜骨干親本；第三類包含3份中國南瓜(10、20、1)。這3個類群中，中印南瓜遠緣雜交材料與印度南瓜遺傳距離相近。中印南瓜遠緣雜交材料拉近了中國南瓜和印度南瓜的遺傳距離，有望成為中印南瓜種間雜交的育種橋。

在遺傳距離20的位置，可以將第二類群細分為2個亞群。一個亞群是以2-錦栗為代表的印度南瓜

圖2 53份南瓜材料形態學性狀聚類Fig.2 Dendrogram of 53 pumpkins derived from clustering analysis based on phenotypic traits

親本；另一個亞群是以3-翠栗6號、5-貝栗4號、4-翠栗318、8-綠亨銀栗和9-新紅板栗等為代表的印度南瓜親本。由此可見，供試骨干親本與市售品種遺傳距離較接近，對于改良同一類型南瓜品種有一定作用，但是培育突破性品種，難度較大。

2.2 分子聚類結果

2.2.1 差異引物的多態性分析 試驗共使用23對SSR標記，擴增61個位點，平均每個引物擴增2.7個條帶。篩選到20個SSR標記，在53份南瓜材料中擴增出55個多態性位點，多態性比例為90%(圖3)。

2.2.2 53份南瓜材料分子聚類分析 NTSYS軟件通過計算53份材料間的遺傳相似系數繪制聚類圖(圖4)。材料間遺傳相似系數在0.520～1.000，以0.680為閾值，可以將供試材料分作3個類群，與南瓜傳統分類的3個種對應，分別為中國南瓜(1、10、17、20、21、47)、美洲南瓜(7)和印度南瓜(剩余材料)。這3個種間，中國南瓜與美洲南瓜親緣關系最近，印度南瓜與中國南瓜和美洲南瓜親緣關系均較遠。

M.Marker(Marker L 50～500 bp)。

在閾值為0.840處，中國南瓜類群可以細分為3個亞群(圖4)。第1個亞群包括2個供試中國南瓜商品種，1-金鉤和10-香芋南瓜，與骨干親本21-PG10，三者相似系數為0.958～0.982，親緣關系近。第2個亞群包含親本20-GSH和47-MO，其中47-MO是中印南瓜遠緣雜交種的母本，第2個亞群與第1個亞群的相似系數為0.88，親緣關系較遠。第3個亞群是17-B5×PG10，這是中印南瓜遠緣雜種自交系B5與中國南瓜親本PG10配置的雜交組合。從聚類結果來看，17-B5×PG10與47-MO相近，與21-PG10較遠，但是17-B5×PG10未與MO或者PG10聚在一起，表明利用中印南瓜遠緣雜交后代與中國南瓜雜交，會在遺傳組成上創造較大變異，產生與現有中國南瓜材料有差別的新組合。

在閾值為0.840處，印度瓜類群被細分為2個亞群(圖4)，第一亞群包含31份南瓜材料，主要是印度南瓜商品種和印度南瓜骨干親本；第二亞群包含15份材料，主要是中印南瓜遠緣雜交自交系及其父本印度南瓜MA以及自交系自配雜交組合。2個亞群在相似系數0.890的位置被明顯分開。在第一亞群中，供試的印度南瓜商品種，2-錦栗和9-新紅板栗、3-翠栗6號和4-翠栗318，兩兩差異不大；6-小甘龍、5-貝栗4號和8-綠亨銀栗，親緣關系較遠。印度南瓜骨干親本23、35、39和41為姊妹系，相似度太高，沒有區分開，它們與2-錦栗和9-新紅板栗相似。14、32和26與小甘龍近緣；22、27、33、34、38、40、43、36、11和24與5-貝栗4號相似；42、37和45與8-綠亨銀栗相似。對于與市售品種相似的親本，應盡量選擇不同類型、遺傳相似系數大的親本相互配組，最大程度地利用雜種優勢，改良現有品種。在第二亞群中，中印南瓜遠緣雜交自交系29-B5和28-B3與父本印度南瓜MA聚在一起；自交系30-B7和31-B9聚在另外一個亞群中，凡與B7雜交的組合，都被聚在這里。

圖4 53份南瓜材料SSR分子標記聚類Fig.4 Dendrogram of 53 pumpkins derived from clustering analysis based on SSR molecular markers

2.3 分子聚類與表型聚類的結果比較

53份南瓜材料的分子聚類結果和表型聚類結果有相同之處。首先，2種聚類方法都將中印南瓜遠緣雜交后代及組合聚為一類，將印度南瓜商品種及印度南瓜骨干親本聚為一類，中國南瓜類型與這兩類被顯著地區分開。根據這個聚類結果，結合30個形態學性狀分析發現，中國南瓜類群表現出果型特異性，如長條蜜本、長條香芋等；中印南瓜遠緣雜交后代及組合類群表現為果實皮色特異性，如粉彩綠、橘黃色等；印度南瓜商品種和骨干親本表現為果實大小和果皮顏色的特異性。表明三者之間無論在分子層面還是表型層面都具有顯著差異。通過南瓜屬種間雜交，增加了現有南瓜品種和育種材料的遺傳多樣性。其次，2種聚類方法都將供試印度南瓜骨干親本與印度南瓜商品種進行了比對歸類。比如，3-翠栗6號、4-翠栗318和5-貝栗4號，在表型聚類和分子聚類中都比較相近。這些結果都表明，供試印度南瓜商品種和印度南瓜骨干親本相似度較高，同質化嚴重，對于培育特色品種缺乏異質基因。此外，對于中印南瓜遠緣雜交后代及組合的聚類，2種聚類方法得到結果非常一致，即B7和B9以及與B7雜交的組合都被聚在一起，B3和B5及其雜交組合被聚為一類。B3、B5、B7和B9是中印南瓜雜交種不同株系的自交系，B3和B5相近，B7和B9相近，在育種實踐中，2種類型2個株系擇其一使用即可。同時，分子聚類與表型聚類的結果也存在不同之處。首先表型聚類不能把美洲南瓜7-皇貝貝和中國南瓜47-MO與印度南瓜區分開；其次表型聚類和分子聚類對骨干親本與南瓜商品種的歸類也不完全相同。

2.4 表型性狀主成分分析

根據53份南瓜材料30個表型數據進行主成分分析，前6個主成分累計貢獻率為88.17%，30個復雜的表型性狀簡化為6個主要因子(表4)。第一主成分特征值為15.98，貢獻率為36.09%，其特征向量凝聚的生物學信息主要是子房和老果皮色。第二主成分特征值為9.58，貢獻率為18.56%，其性狀特征值較大的性狀為子房和老果的條斑網格。第三主成分特征值為5.22，貢獻率為12.42%，果型指數的特征值較大。第四主成分特征值為3.33，貢獻率為8.05%，老果皮色和條斑網格是該主成分的特征，綜合了第一和第二主成分的老果表皮的生物學信息。第五主成分特征值為2.54，貢獻率為7.73%，果實口感評價的特征值較大。第六主成分特征值為1.29，貢獻率為5.32%，其性狀特征值較大的性狀為分枝和萌蘗習性。由此可見，本研究涉及的30個表型性狀中，幼果和成熟果實的皮色、果實表面的條斑網格、果型指數、口感和植株分枝萌蘗等性狀是區別53份材料的最主要的特征。

表4 53份南瓜材料30個表型數據的主成分分析結果Tab.4 The results of principal component analysis derived from 30 morphological traits of 53 pumpkins

2.5 利用主要因子對53份南瓜材料進行二次聚類

利用主要因子對53份南瓜材料進行二次聚類的結果見圖5。在距離15.5的位置，供試材料被聚為8大類群。其中第Ⅰ類、第Ⅱ類和第Ⅵ類包含所有的中印南瓜遠緣雜交后代(16份)，B7和B9被單獨聚在第Ⅱ類。第Ⅲ類、第Ⅳ類和第Ⅴ類包含所有的印度南瓜骨干親本及商品種。5份中國南瓜(1、10、20、21、47)和1份老果皮色為草綠色、肉質水質絲滑的印度南瓜FG1-1，被聚類到第Ⅶ類。17-B5×PG10被單獨聚在第Ⅷ類。

二次聚類的結果與第一次利用30個表型性狀進行聚類的結果相比更加準確，與分子聚類結果符合度更高。首先，第一次表型聚類的第Ⅱ類“印度南瓜骨干親本”中，包含中國南瓜47-MO，二次聚類將它分離出來，與中國南瓜聚在一起，更符合分子聚類結果(圖4)。其次，兩次聚類結果中16份中印南瓜遠緣雜交后代，分布基本相同，但是二次聚類將B7和B9單獨聚為第Ⅱ類，將B5×PG10單獨聚為第Ⅷ類，與分子聚類結果更吻合。此外，二次聚類將印度南瓜骨干親本及商品種分為第Ⅲ類、第Ⅳ類和第Ⅴ類，這三類與第一次表型聚類的第Ⅱ類的2個亞類分布不同。與分子聚類結果更符合的是二次聚類結果。主要表現在分子聚類將2、9、23、35、39聚為一類，這一類與其他印度南瓜材料遺傳距離較遠；這個結果與二次聚類將37、38、24、35、42、25、27、9、23、36、39、2、14聚為第Ⅳ類，與其他材料(第Ⅲ和Ⅴ類)分開的結果吻合。而第一次表型聚類結果中2、9、23、35、39被分散到第Ⅱ類的2個亞群，區分不明顯(圖2)。因此，利用主要因子對53份南瓜材料進行二次聚類，獲得了與分子聚類具有較高符合度的結果，這些主成分因子可作為簡化表型性狀統計的指標。

圖5 基于6個主成分因子的53份南瓜材料形態學性狀聚類Fig.5 Dendrogram of 53 pumpkins derived from clustering analysis based on the 6 principal component factors

3 結論與討論

本研究在選擇食用南瓜商品種時，主要是針對老熟果蒸煮食用的南瓜品種。對美洲南瓜類型，只選擇食用方式和表型特征與此類南瓜相似的7-皇貝貝，而沒有選擇長條筍瓜和圓形筍瓜的品種。主要是考慮到長條或者圓形筍瓜，以食用嫰果為主，且筍瓜材料種間遺傳組成差異較大[34]，筍瓜與中國南瓜和印度南瓜差異較大[35]，因此，增加筍瓜類型，會使供試材料生物多樣性指數和遺傳相似系數異常，不利于本研究數據分析。

供試材料的分子聚類與第一次利用30個表型性狀進行聚類的結果不完全統一的主要原因，可能是由于試驗中使用的分子標記，雖然是在前期SSR擴增試驗中具有穩定多態性的引物，但是數目有限，不能完全代表供試材料廣泛的遺傳背景[36]，同時，這些分子標記與30個表型性狀也不能完全對應[37]，因此導致二者的聚類結果不能統一。主成分分析被廣泛應用于作物表型性狀的核心指標篩選[38]，提高表型聚類與分子聚類的吻合度[39]，是現代育種的重要方法。從30個表型性狀的主成分分析中，根據貢獻率得到6個主成分，包括子房和成熟果實的皮色、果實表面的條斑網格、果型指數、口感和植株分枝萌蘗等8個性狀。利用這8個性狀對53份南瓜材料進行二次表型聚類，得到了與分子聚類符合度更高的結果。其原因可能在于，不同表型性狀對主成分因子貢獻率不同[38]。剔除葉色、株型、株高、花期等在供試材料間表現較為一致、貢獻率較低的表型特征，減少表型聚類的干擾因素，突出貢獻率較大的主成分因子，最終獲得較為準確的聚類結果。這樣，一方面解決了表型聚類與分子聚類結果不統一的問題，另一方面為今后食用南瓜性狀調查簡化了調查指標，避免了性狀間相互作用造成的重復選擇。

本研究的3次聚類結果均表明，現有印度南瓜品種及育種材料在表型和分子層面親緣關系較近，存在同質化。周秦等[14]對26份南瓜種質進行遺傳多樣性分析，也發現同樣問題，并且指出，同質型南瓜親本或者品種即便再組合，也還會和原始親本聚在一起。高斌等[40]在對北方花生育成品種以及骨干親本進行分子標記鑒定和系譜分析時，發現相同的花生骨干親本在不同地區被反復利用，導致花生品種間相似度升高。研究指出，加大相對封閉地區的南瓜材料引種，以及利用種間雜交，能夠拓寬南瓜遺傳多樣性[41]。3次聚類都將中印南瓜種間雜交自交系及其新配組合聚為一類，與供試印度南瓜商品種及骨干親本明顯區分開。這與王瑞等[24]得到的結果相同。他們在研究95份南瓜資源親緣關系的時候發現，遠緣雜交中間類型被聚在一起，形成一個分枝。這些都顯示了種間雜交對增加南瓜遺傳多樣性的有效性。通過種間雜種，為培育特色南瓜新品種提供異質基因，推陳出新。供試材料中，18-ZVF和48-ZVG是利用中印南瓜遠緣雜種自交系與骨干親本自配雜交組合，植株耐熱，果肉粉香，淀粉含量高；在參加2021年新疆昌吉中國園藝學會南瓜研究分會南瓜新品種展示會時，受到承辦方的好評。