M1型巨噬細胞對小鼠膀胱癌MB49細胞活力、遷移、侵襲及凋亡的影響*

張暑軍， 李青青， 喬春林， 勾 璇， 王新敏， 章 樂△

（1石河子大學醫學院病理生理學教研室/新疆地方病與民族高發病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000；2石河子大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科，新疆 石河子 832008）

膀胱癌是常見的惡性腫瘤，在泌尿生殖道腫瘤中膀胱癌發病率位居第一位［1］。研究表明，腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）與膀胱癌的發生、發展關系密切，而腫瘤相關巨噬細胞是腫瘤微環境中的主要組成部分，在膀胱癌浸潤免疫細胞中的比例可高達50%［2-3］。腫瘤相關巨噬細胞活化類型分為兩種表型：M1 型和M2 型［4］。M1 型巨噬細胞可被干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）或脂多糖（lipopolysac?charide，LPS）激活，并分泌大量促炎細胞因子如白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，表達高水平的CD86 和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），主要誘導Th1 型免疫應答，被稱為腫瘤殺傷性巨噬細胞，一直被認為具有抑瘤效應［5-6］。但研究顯示，M1 型巨噬細胞也存在促瘤作用，可參與腫瘤的惡性進展。在乳腺癌中，M1 型巨噬細胞能誘導乳腺癌細胞T47-D和MCF-7的上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并增強誘導細胞的遷移和侵襲能力［7］；在腦膠質瘤中，M1型巨噬細胞可促進腦膠質瘤U251 細胞的侵襲［8］。目前M1 型巨噬細胞在膀胱癌發生發展中的作用仍不清楚。本項工作以小鼠膀胱癌細胞株MB49 為研究模型，并轉化小鼠RAW264.7 巨噬細胞為M1 型巨噬細胞，將其與MB49細胞通過Transwell小室進行體外雙層共培養，觀察M1型巨噬細胞對MB49細胞活力、遷移、侵襲及凋亡的影響。

材料和方法

1 材料

小鼠RAW264.7 巨噬細胞系購自中國科學院細胞庫；小鼠膀胱癌MB49細胞購自中國上海賽百慷生物有限公司。 胎牛血清購自Bioloical Industries；DMEM、青-鏈霉素和PBS 購自Gibco；LPS 購自Sig?ma；CCK-8 購自日本同仁公司；抗小鼠CD86 抗體購自Invitrogen；兔抗iNOS 抗體購自Abcam；兔抗CD86抗體購自Bioss；小鼠CD86-PE 流式抗體購自Invitro?gen；Hoechst 33258、裂解液PMSF 和RIPA、Western blot 制膠液均購自北京索萊寶科技有限公司；0.4 μm和0.8 μm的Transwell小室購自Corning。

2 方法

2.1 RAW264.7 細胞和MB49 細胞的培養配制完全培養液（含1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養液），將細胞置于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中。觀察細胞狀態并換液，當培養瓶細胞生長至80%～90% 時予以傳代。傳代培養3次后取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 LPS 誘導RAW264.7 細胞向M1 型極化將處于對數生長期的RAW264.7 細胞按3×108L?1接種于6孔板中，培養液每孔2 mL，鋪板后細胞培養12 h，以此時記為0 h，然后加入不同濃度的LPS刺激，分別為0、50、100 和200 μg/L 4 個組，每組3 個復孔，培養細胞24 h［9-10］。

2.3 免疫熒光細胞化學染色法檢測RAW264.7 巨噬細胞iNOS 和CD86 表達情況取出LPS 刺激24 h后的細胞，4% 多聚甲醛固定細胞15 min，Triton X-100 破細胞膜3 min，加入牛血清白蛋白于37 ℃恒溫封閉30 min，分別加入兔抗iNOS抗體（1∶100）和小鼠抗CD86 抗體（1∶100），置于濕盒內37 ℃恒溫孵育3.5 h，在暗室中滴加FITC 標記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶50）和FITC 標記的山羊抗鼠Ⅱ抗（1∶50），避光，置于37 ℃環境中孵育2 h，PI（1∶1 000）染核10 min，甘油封片［9］。采集細胞圖像，再進行半定量分析。

2.4 Western blot 分析RAW264.7 巨噬細胞iNOS 和CD86 蛋白表達情況取出細胞，加入配好的裂解液（PMSF∶RIPA 為1∶100），每孔100～200 μL，將6 孔板置于冰盒上裂解20～30 min。干凈的細胞刮刮落貼壁細胞，將液體吸至1.5 mL 的EP 管中，提前預冷離心機至4 ℃，13 684×g離心15 min，測定蛋白濃度，配平，加入loading buffer，煮蛋白100 ℃，10 min，冷卻后蛋白于?80 ℃冰箱保存。制膠（5% 濃縮膠和10% 分離膠）；電泳，電壓為80 V，2 h；濕轉，電壓為80 V，1.5 h。于搖床上室溫封閉2～3 h，用含50 g/L 牛血清白蛋白的TBST 配制Ⅰ抗（兔抗鼠CD86 單克隆抗體按1∶1 000稀釋，兔抗鼠iNOS單克隆抗體按1∶500稀釋，鼠抗β-actin 單克隆抗體按1∶10 000 稀釋）；Ⅱ抗為HRP 標記的羊抗兔IgG（1∶10 000）或羊抗鼠IgG（1∶20 000）；化學發光試劑盒（A 液∶B 液=1∶1）顯影，并于暗室壓片［11］。掃描條帶灰度值。圖像采集后使用ImageJ 軟件進行分析，分別計算CD86 和iNOS 與β-actin的比值。

2.5 流式細胞術檢測RAW264.7 巨噬細胞表面CD86 的表達情況胰酶消化收集巨噬細胞，用1×PBS 洗2 次，細胞表面CD86 的表達情況用直接免疫熒光法進行檢測。每100 μL的1× PBS加入抗體（PE標記的CD86 抗體）1 μL，用配好的抗體稀釋液重懸細胞，避光，置于37 ℃環境中，染色30 min。1× PBS洗2次，加入300～500 μL的1× PBS重懸細胞，上機檢測［11］。實驗結果為膜分子表達陽性細胞百分率。

2.6 構建巨噬細胞與膀胱癌細胞的共培養體系實驗分為3 組：MB49 組、MB49 與M0 巨噬細胞共培養組（M0+MB49 組）及MB49 與M1 巨噬細胞共培養組（M1+MB49 組），于6 孔板上放置膜孔徑為0.4 μm的Transwell 培養小室，將MB49 細胞和不同亞型的RAW264.7 巨噬細胞制備成均勻的細胞懸液，上層按實驗分組分別加入M0 和M1 亞型巨噬細胞，下層加入膀胱癌細胞MB49，構建共培養體系，2種細胞均勻分布于各層，共培養。

2.7 CCK-8 實驗檢測各組MB49 細胞的活力將不同分組的MB49細胞制備成均勻的細胞懸液，每組進行細胞計數，把細胞密度調整為4×107L?1，每個試驗組設3 個復孔；保證每孔細胞密度基本相同，按上述實驗分組將單細胞懸液以每孔4×103接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中繼續培養；在24 h 后將96 孔板終止培養。每孔加入CCK-8 溶液10 μL，輕輕混勻，把培養板放在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中2 h；利用酶標儀測定450 nm的吸光度（A）值；計算細胞相對活力，并行統計分析。

2.8 劃痕實驗檢測各組MB49細胞水平方向的遷移能力待實驗組中MB49 細胞長至90% 左右時，用10 μL 吸頭垂直6 孔板筆直劃出兩條水平的劃痕，棄去培養液，用PBS清洗3次，洗去劃掉的細胞，然后加入無血清的DMEM 培養液，顯微鏡拍照，此時記為0 h，繼續于培養箱培養24 h，再次于顯微鏡下拍照，用ImageJ軟件計算各組MB49細胞遷移的面積。

2.9 Transwell實驗檢測各組MB49細胞的侵襲及垂直方向的遷移能力取出細胞，胰酶消化MB49收集細胞，用不含血清的培養液重懸細胞，向Transwell小室中放入無血清培養液重懸的細胞，保證各組細胞數量一致。Transwell 侵襲實驗需提前在小室中鋪上一層基質膠；于24孔板下室中加入500 μL含20% 血清的完全培養液，將小室放入24 孔板中，培養箱中培養24 h；取出Transwell 小室，PBS 洗兩次，4% 多聚甲醛固定30 min；0.1% 結晶紫染色20 min，PBS 洗3次，棉簽擦去小室里未遷移的細胞；風干小室，再于倒置熒光顯微鏡下拍照［12］；用直接計數法或ImageJ軟件計算出各組MB49細胞穿過的數量。

2.10 Hoechst 33258 染色檢測各組MB49 細胞的凋亡情況取出細胞，棄上清液，PBS 洗3 次，4% 多聚甲醛固定10～15 min；PBS 洗3 次，加入稀釋好的Hoechst 33258 染色液500 μL，室溫避光孵育20～30 min；PBS 洗3 次，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照［13］，用ImageJ軟件計算出各組MB49細胞凋亡的數量。當細胞發生凋亡時，Hoechst 33258 染料穿透細胞膜與雙鏈DNA 結合，產生比熒光染料自身更強的熒光。因此，凋亡細胞的熒光強度高于正常細胞。若鏡下觀察細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，即熒光顯微鏡下觀察到亮藍光，說明細胞發生凋亡。

2.11 ELISA 檢測各組炎癥因子IL-6 的水平收集各組共培養后的細胞培養液上清于EP管中，1 100×g離心5 min，每組取100 μL細胞培養液加入至已被抗體包被的96 孔酶標板中，按照ELISA 試劑盒說明書對IL-6的含量進行檢測。

3 統計學處理

SPSS 23.0 軟件對數據進行統計學分析。實驗數據均為至少3 次獨立重復實驗結果，并以均數±標準差（mean±SD）表示。采用方差分析（或t檢驗）進行組間差異比較，并進一步采用LSD 進行組間兩兩比較。GraphPad Prism 5.0 軟件作圖。P<0.05 表示差異有統計學意義。

結 果

1 Western blot 檢測LPS 刺激后RAW264.7 巨噬細胞中CD86和iNOS蛋白表達水平

Western blot 結果顯示，0、50、100 和200 μg/L 的LPS刺激巨噬細胞24 h后，與對照組（即0 μg/L組）相比，RAW264.7巨噬細胞的CD86和iNOS蛋白表達均不同程度地升高，各組CD86蛋白的相對表達量分別為 1.00±0.00、1.11±0.10、1.31±0.16 和 1.12±0.09），各組iNOS 蛋白的相對表達量分別為1.00±0.00、3.45±1.24、5.24±0.60 和1.51±0.68；當LPS濃度為100 μg/L時，CD86及iNOS蛋白的表達水平最高，與對照組相比，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖1、2。

2 免疫熒光檢測LPS 刺激后RAW264.7 巨噬細胞中iNOS和CD86蛋白表達及分布

Figure 1.The expression of CD86 protein in macrophages detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 50 μg/L LPS group.圖1 Western blot檢測巨噬細胞CD86蛋白的表達

Figure 2.The expression of iNOS protein in macrophages detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 50 μg/L LPS group；△P<0.05 vs 100 μg/L LPS group.圖2 Western blot檢測巨噬細胞iNOS蛋白的表達

免疫熒光結果顯示，0、50、100 和200 μg/L 的LPS刺激巨噬細胞24 h后，與對照組（即0 μg/L組）相比，巨噬細胞上的CD86 和iNOS 蛋白表達均不同程度地升高，激光共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光亮度增強，各組CD86 蛋白的相對表達量分別為0.03±0.00、0.05±0.00、0.06±0.00 和0.05±0.01，各 組iNOS 蛋白的相對表達量分別為0.05±0.01、0.06±0.00、0.08±0.00 和0.07±0.01；當LPS 濃 度 為100 μg/L 時，CD86 及iNOS 蛋白表達最高，激光共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光亮度最亮，與對照組及50 μg/L LPS 組相比，差異均具有統計學意義（P<0.05），見圖3、4。

3 流式細胞術檢測100 μg/L LPS 刺激RAW264.7巨噬細胞后M1型巨噬細胞所占比例

免疫熒光及Western blot 結果顯示100 μg/L LPS組M1 型標志物CD86 和iNOS 蛋白表達最高，進一步通過流式細胞術檢測100 μg/L LPS 組M1 型巨噬細胞所占比例，結果顯示，100 μg/L LPS組CD86陽性細胞百分率為（95.60±3.21）% ，顯著高于對照組［（39.17±2.62）%，P<0.01］，見圖5。

4 M1巨噬細胞抑制MB49細胞的活力

M0、M1 巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞MB49 共培養后，CCK-8 實驗檢測各組MB49 細胞活力。結果顯示，與單獨的MB49 組（1.00±0.00）相比，MB49+M0組細胞活力（0.96±0.01）顯著下降（P<0.01）；與MB49+M0 組相比，MB49+M1 組細胞活力（0.77±0.02）顯著下降（P<0.01），見圖6。

5 M1型巨噬細胞抑制MB49細胞的遷移能力

M0、M1 巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞MB49 共培養后，細胞劃痕測各組MB49細胞遷移能力。結果顯示，MB49 組細胞的遷移面積為（30.83±1.90）%，MB49+M0 組細胞的遷移面積為（21.85±0.56）%；與MB49 組及MB49+M0 組相比，MB49+M1 組MB49 細胞的遷移面積為（10.00±0.84）%，遷移能力受到顯著抑制（P<0.01），見圖7。

Figure 3.Immunofluorescence detection of CD86 expression on the surface of macrophages.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 50 μg/L LPS group；△P<0.05 vs 100 μg/L LPS group.圖3 免疫熒光檢測巨噬細胞表面CD86的表達

Figure 4.Immunofluorescence detection of iNOS expression on the surface of macrophages.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=5.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 50 μg/L LPS group；△P<0.05 vs 100 μg/L LPS group.圖4 免疫熒光檢測巨噬細胞表面iNOS的表達

6 M1型巨噬細胞抑制MB49細胞的遷移和侵襲能力

Figure 5.Flow cytometric detection of CD86 expression in macrophages.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control group.圖5 流式細胞術檢測巨噬細胞CD86的表達

Figure 6.The viability of MB49 cells in each group detected by CCK-8 assay.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs MB49 group；##P<0.01 vs MB49+M0 group.圖6 CCK-8檢測各組MB49細胞活力

M0、M1 巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞MB49 共培養后，Transwell實驗檢測各組MB49細胞遷移和侵襲能力。（1）遷移能力：MB49+M1 組遷移至Transwell 小室濾膜下表面的細胞數為63.8±5.7，顯著（P<0.01）低于MB49 組（214.0±13.7）和MB49+M0 組（167.2±13.0）；（2）侵襲能力：MB49+M1 組侵襲至Transwell小室濾膜下表面的細胞數為32.0±4.6，顯著（P<0.01）低 于MB49 組（160.8±9.9）和MB49+M0 組（131.2±8.0），見圖8。

7 M1型巨噬細胞促進MB49細胞的凋亡

M0、M1 巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞MB49 共培養后，Hoechst 33258染色檢測各組MB49細胞凋亡情況。結果顯示，MB49 組凋亡細胞百分率為（11.80±0.84）%；與MB49 組相比，MB49+M0 組凋亡細胞百分率為（16.04±1.97）%，細胞凋亡數量顯著增多（P<0.01）；與MB49 組及MB49+M0 組相比，MB49+M1 組凋亡細胞百分率為（47.46±3.74）%，細胞凋亡數量顯著增多（P<0.01），見圖9。

8 ELISA檢測各組炎癥因子IL-6水平

ELISA 檢測各組炎癥因子IL-6 的分泌水平，結果顯示，MB49+M1 組細胞培養上清液中IL-6 的濃度為（72.11±3.66）ng/L，顯著（P<0.05）高于MB49 組［（26.89±10.78） ng/L］和MB49+M0 組［（46.11±6.83）ng/L］，見圖10。

討 論

腫瘤相關巨噬細胞是腫瘤微環境的關鍵細胞，在腫瘤存活和進展中起著關鍵性作用，能響應于各種微環境信號從而改變它的功能表型，主要分為M1型和M2型巨噬細胞［14-15］。

根據以往的研究，M1 型巨噬細胞一直被認為對腫瘤的生長起抑制作用，而M2型巨噬細胞促進腫瘤的生長［2，15］。Jiang 等［16］的研究表明，M1 型巨噬細胞抑制食管鱗狀細胞癌細胞的遷移和侵襲。在肺癌中，M1 型巨噬細胞抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡，發揮抗腫瘤作用［17］。但近年來有研究表明，M1型巨噬細胞存在促瘤的作用，Jin等［8］觀察到M1型巨噬細胞可促進腦膠質瘤U251 細胞的侵襲；Bednarc?zyk 等［7］檢測到M1 型巨噬細胞能誘導乳腺癌細胞T47-D 和MCF-7 發生EMT，并增強細胞的遷移和侵襲能力，靶向M1巨噬細胞可能會抑制EMT并限制乳腺癌的侵襲潛力。目前M1 型巨噬細胞對腫瘤是促進還是抑制作用仍然存在爭議，M1 型巨噬細胞在膀胱癌發生和進展中的作用仍不明確，有待進行更多的基礎研究。因此，本研究旨在體外明確M1型巨噬細胞對小鼠膀胱癌細胞株的影響。

Figure 7.The migration of MB49 cells in each group detected by scratch assay.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs MB49 group；##P<0.01 vs MB49+M0 group.圖7 劃痕實驗檢測各組MB49細胞遷移情況

腫瘤微環境中巨噬細胞的極化與膀胱癌的發生發展相關［18-20］。Takeuchi 等［19］表明，高密度M2 型巨噬細胞在膀胱癌中可影響微血管、病理結果、腫瘤分級和侵襲性，是預后較差的因素。有體外實驗和裸鼠移植瘤模型實驗均證實，M2 型巨噬細胞會抑制膀胱癌細胞凋亡，從而促進膀胱癌的增殖和侵襲［20］。而M1 型巨噬細胞與膀胱癌細胞的關系研究甚少。有研究觀察到，在外界刺激下，巨噬細胞會發生極化，表型、形態及功能方面的改變，通常會以旁分泌的方式分泌一些物質來調節腫瘤細胞的存活和侵襲［18］。為了觀察微環境中M1 型極化的巨噬細胞對膀胱癌的影響，本實驗選用小鼠RAW264.7 巨噬細胞和小鼠膀胱癌細胞株MB49 為研究模型。在體外先將RAW264.7 巨噬細胞誘導為M1 亞型，通過對M1 型巨噬細胞表型標志物CD86 和iNOS 進行檢測［21-22］，構建了成功的M1 型巨噬細胞極化模型且極化比例可達90% 以上，為后續研究M1型巨噬細胞和小鼠膀胱癌細胞株MB49 的關系奠定了實驗基礎。本研究隨后將M1 型巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞株MB49通過Transwell小室在體外進行雙層共培養，觀察癌細胞MB49活力、遷移能力和侵襲能力的變化及細胞凋亡的情況，結果顯示M1型巨噬細胞與小鼠膀胱癌細胞株MB49 共培養后，膀胱癌細胞活力降低，遷移和侵襲能力減弱，細胞凋亡增多，說明M1 型巨噬細胞能抑制小鼠膀胱癌細胞的生長。在以往對膀胱癌的研究中，Dufresne 等［23］觀察到與M1 型巨噬細胞共培養的膀胱癌細胞株T24 其活細胞數量較低，同時M1 巨噬細胞衍生因子抑制T24 細胞生長；在裸鼠膀胱癌皮下移植瘤模型中，PD-1 抑制劑nivdumab可使腫瘤組織中M2 型巨噬細胞向M1 型極化，抑制皮下移植瘤的生長速度［20］，這與我們的研究結果相一致，證明了M1 巨噬細胞在膀胱癌中起抑癌作用。為了進一步探究微環境中分泌因子與膀胱癌細胞之間的關系，本實驗觀察了各組中炎癥因子IL-6 的濃度，結果顯示MB49+M1 組的IL-6 濃度要顯著高于其它組。而M1 型巨噬細胞高分泌促炎因子IL-6，推測M1 型巨噬細胞可能通過分泌促炎因子來影響癌細胞的生長。研究也顯示，豬苓多糖可通過促進巨噬細胞中促炎因子如IL-1β、TNF-α和iNOS以及表面分子CD86、CD16、CD23和CD40的表達，將巨噬細胞極化為M1型，從而可以抑制膀胱癌細胞T24和EJ細胞的增殖，調節其凋亡，并抑制遷移和EMT［24］。這些研究進一步支持了我們的推測，說明M1型巨噬細胞分泌的促炎因子可以抑制膀胱癌的生長。但我們在本實驗中只檢測了一種炎癥因子的分泌，且腫瘤具有異質性，其微環境作用關系較為復雜，有待更多的研究去證明其中的作用關系。

Figure 8.The migration and invasion abilities of MB49 cells in each group detected by Transwell assay.The scale bar=100 μm.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs MB49 group；##P<0.01 vs MB49+M0 group.圖8 Transwell實驗檢測各組MB49細胞遷移和侵襲能力

綜上所述，腫瘤微環境中巨噬細胞極化表型的改變影響膀胱癌發展，M1 型巨噬細胞能夠抑制小鼠膀胱癌細胞的活力、遷移與侵襲，促進膀胱癌細胞的凋亡。目前刺激腫瘤相關巨噬細胞從M2型到M1型轉變已成為腫瘤免疫治療的一種有前途的策略。有研究通過研發智能納米藥物刺激巨噬細胞表型變化來抑制腫瘤的生長和轉移［25］。因此，通過改變膀胱癌微環境中的巨噬細胞極化表型，使其向M1型極化可能是治療膀胱癌的潛在方式，而我們的這一研究也為臨床上膀胱癌的治療提供了參考資料。

Figure 9.The apoptosis of MB49 cells in each group detected by Hoechst 33258 staining.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs MB49 group；##P<0.01 vs MB49+M0 group.圖9 Hoechst 33258染色檢測各組MB49細胞凋亡情況

Figure 10.The secretion levels of inflammatory factor IL-6 de?tected by ELISA.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs MB49 group；#P<0.05 vs MB49+M0 group.圖10 ELISA檢測各組炎癥因子IL-6的分泌水平