PI3K/SGK1信號通路上調小鼠肺上皮鈉通道表達的研究*

馬 青， 李長毅， 王導新， 鄧 旺

（重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科，重慶 400010）

上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）是肺泡腔內鈉水轉運的重要環節，能有效地清除聚集的水腫液，對維持氣體交換和改善氧合至關重要，可明顯降低急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者的病死率［1］。磷酯酰肌醇3-激酶（phos?phatidylinositol 3-kinase，PI3K）是參與調節ALI 肺泡液體清除（alveolar fluid clearance，AFC）的重要信號通路，但其下游的作用靶點及與ENaC 的關系仍未完全闡明清楚［2］。血清-糖皮質激素調節激酶1（serumglucocorticoid regulated kinase 1，SGK1）是胰島素激活PI3K 通路發揮效應的下游重要靶點，也是調節ENaC 表達的關鍵因子［3］。本研究通過建立小鼠ALI模型，觀察PI3K/SGK1信號通路對AFC 及ENaC 表達的影響，探討PI3K/SGK1信號通路在ALI中的作用。

材料和方法

1 實驗材料

SPF 級雄性C3H/HeN 小鼠24 只（7～9 周，體重為20～24 g）購自重慶醫科大學動物實驗中心［生產許可證號為SCXK（渝）2007-0001］。脂多糖（lipopolysac?charide，LPS；O111：B4）和伊文思藍（Evans blue）購自Sigma；重組人胰島素購自EliLilly；PI3K p85α小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購自Santa Cruz；SGK1siRNA 由Gene Pharma 設計并合成；ENaC α亞基（α-ENaC）、ENaC β亞基（β-ENaC）、ENaC γ亞基（γ-ENaC）、PI3K p85α、SGK1、磷酸化SGK1（Ser422）及β-actin 單克隆抗體購自Santa Cruz；RNA 提取試劑盒和RT-PCR 試劑盒購自TaKaRa；Lipofectamine?2000轉染試劑購自Invitrogen。

2 實驗方法

2.1 動物模型與分組小鼠給予巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉后，分離暴露頸靜脈，留置靜脈導管，氣道內滴入LPS（5 mg/kg）建立ALI 模型［4］。24 只小鼠隨機分為對照組、ALI 組、胰島素組和PI3KsiRNA組，每組6 只小鼠。對照組：經頸靜脈泵入等體積的生理鹽水；ALI 組：給予LPS 建立ALI 模型后，持續泵入等體積的生理鹽水；胰島素組：給予LPS 建立ALI模型后，持續經頸靜脈泵入胰島素（0.1 U·kg?1·h?1）［5］；PI3KsiRNA 組：建立ALI 模型，持續泵入胰島素（0.1 U·kg?1·h?1）的同時，100 μgPI3K p85αsiRNA稀釋于100 μL生理鹽水中通過移液管直接導入小鼠喉嚨，立即閉合小鼠氣道［6］。對照組、ALI 組和胰島素組中以同樣方式給予等量的空白siRNA 作為參照。8 h后處死小鼠，收集肺組織標本。

2.2 細胞培養與轉染小鼠原代肺泡上皮II 型細胞的分離培養參照文獻［7］進行。 依據Lipo?fectamine?2000 轉染的要求，細胞分別轉染PI3KsiRNA 和SGK1siRNA。轉染72 h 后，細胞于含或不含200 mU/L 胰島素的培養液中培養2 h。細胞分組：對照組（無胰島素）、胰島素組、PI3KsiRNA（胰島素+PI3K p85αsiRNA）組和SGK1siRNA（胰島素+SGK1siRNA）組。

2.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）收集小鼠麻醉后，打開胸腔，用腰麻導管做氣管置管，用1 mL 生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，共3次，回收率達80%～90%。將收集的BALF 取少許置于白細胞計算盤進行細胞計數，在高倍鏡下計數除上皮細胞及紅細胞外的所有細胞。BALF以14 000×g離心10 min后沉淀的細胞再加1 mL RPMI-1640細胞培養液，搖勻后取20 μL做細胞計數，最終取4×104個細胞用Diff-Quik染色，觀察總細胞數和中性粒細胞數。

2.4 AFC 測定游離右肺組織并行氣管插管，注入100% 氮氣后，將含0.15 g/L Evans blue 標記的5% 白蛋白等滲生理鹽水（5 mL/kg）經導管灌入小鼠肺組織，機械通氣1 h 后測定肺泡腔內Evans blue 標記的白蛋白濃度，根據公式計算：AFC（%）=（Vi?Vf）/Vi×100%，Vf=Vi×Pi/Pf［8］。Vi：起始注入肺泡內液體量；Vf：最后肺泡內液體量；Pi：起始注入的Evans blue 標記的白蛋白濃度；Pf：最后Evans blue 標記的白蛋白濃度。

2.5 免疫熒光實驗小鼠肺組織10% 福爾馬林固定，石蠟包埋切片，厚度5 μm。10% 胎牛血清水浴箱封閉1 h 后，PBS 洗凈3次后，分別與α-ENaC、β?ENaC 和γ-ENaC Ⅰ抗4 ℃冰箱孵育過夜。PBS 沖洗3 次，再與熒光標記Ⅱ抗（Alexa Fluor 594 goat anti?rabbit IgG）37 ℃水浴箱孵育1 h，PBS 沖洗3次。加DAPI 染核，PBS 沖洗3 次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.6 RT-PCR 實驗提取細胞總RNA，根據RT-PCR試劑盒要求，進行逆轉錄合成cDNA。PCR 條件：預變性94 ℃1 min；變性94 ℃30 s，退火53 ℃（α -ENaC）、53 ℃（β-ENaC）、55 ℃（γ-ENaC）和55 ℃（βactin）30 s，72 ℃1 min，30 個循環。PCR 引物序列如下：α-ENaC 的上游引物為5'-TACCCTTCCAAG?TATACACAGC-3'，下游引物為5'-CAGAAGGAGA?CTCCGAATTAGT-3'，產物509 bp；β-ENaC 的上游引物為5'-GCTAAAGAGCTAGCAGTAATGG-3'，下游引物為5'-CTGGTGTTTGTTATGCCTAGAG-3'，產物406 bp；γ-ENaC 的上游引物為5'-GGATCCTGAGAGAGA?ATCATGC-3'，下游引物為5'-GTGTCCAGCTAT?GCCCTTTAAC-3'，產物363 bp；β-actin的上游引物為5'-GTACAACCTTCTTGCAGCTCCT-3'，下游引物為5'-ACAGGATTCCATACCCAGGAAG-3'，產物871 bp。PCR 產物在1.0% 瓊脂糖上進行凝膠電泳。Quantity One 軟件分析目的條帶密度，以目的條帶與β-actin比值作為結果進行比較。

2.7 Western blot 實驗提取細胞膜蛋白，經10%SDS-PAGE 分離后，轉移至硝酸纖維素膜上。5% 脫脂奶粉封閉1 h 后，分別與抗體（α-ENaC 和γ-ENaC，1∶300；β?ENaC、SGK1 和磷酸化SGK1，1∶500；PI3K p85α，1∶1 000；β-actin，1∶2 500）4 ℃孵育過夜。用Tris 緩沖液+Tween 20（TBST）洗膜3 遍，然后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育1.5 h，ECL 顯色。凝膠成像系統掃描，Quantity One 軟件分析目的條帶吸光度（A）值，以目的條帶與β-actin比值作為結果進行分析。

3 統計學處理

用SPSS 16.0 統計軟件分析處理結果。所有計量數據均以均數±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BALF中細胞總數和中性粒細胞數變化

與對照組比較，ALI 組BALF 中細胞總數和中性粒細胞數顯著增加（P<0.05）；與ALI 組比較，胰島素組BALF 中細胞總數和中性粒細胞數顯著降低（P<0.05）；與胰島素組比較，PI3KsiRNA干預后BALF中細胞總數和中性粒細胞數顯著升高（P<0.05），見表1。

表1 BALF中細胞總數和中性粒細胞數變化Table 1.Numbers of total cells and neutrophils in BALF（×104 L?1.Mean±SD. n=6）

2 AFC情況

與對照組比較，模型組AFC顯著降低（P<0.05）；胰島素治療后，AFC 顯著提高（P<0.05）；PI3KsiRNA干預后，AFC 較胰島素組顯著降低（P<0.05），見圖1。

Figure 1.Changes of alveolar fluid clearance in each group.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs ALI group；△P<0.05 vs insulin group.圖1 各組肺泡液體清除率變化情況

3 免疫熒光染色檢測肺組織ENaC蛋白表達

與對照組比較，ALI 組α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的表達減少；胰島素組α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的表達增加；PI3KsiRNA 干預后α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的表達減少，見圖2。

4 肺泡上皮細胞ENaC mRNA表達

與胰島素組比較，PI3KsiRNA 組中α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的mRNA 表達顯著降低（P<0.05）；與胰島素組比較，SGK1siRNA 組中α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC 的mRNA 表達顯著降低（P<0.05），見圖3及表2。

5 肺泡上皮細胞ENaC蛋白表達

與胰島素組比較，PI3KsiRNA 組中α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的蛋白表達顯著降低（P<0.05）；與胰島素組比較，SGK1siRNA 組中α-ENaC、β-ENaC 和γ -ENaC 的蛋白表達顯著降低（P<0.05），見圖4及表2。

表2 各組肺泡上皮鈉通道的表達Table 2.Expression of ENaC in each group（Mean±SD. n=6）

6 肺泡上皮細胞SGK1磷酸化水平

與對照組比較，胰島素組SGK1磷酸化水平顯著升高（P<0.05）；與胰島素組比較，PI3KsiRNA 干預后SGK1磷酸化水平顯著降低（P<0.05）；與胰島素組比較，SGK1siRNA 干預后SGK1 磷酸化水平顯著降低（P<0.05），見圖5。

討 論

Figure 2.The expression of ENaC in lung tissues of each group detected by immunofluorescence staining.The scale bar=50 μm.圖2 免疫熒光染色檢測各組肺組織ENaC表達

Figure 3.The mRNA levels of α-，β- and γ-ENaC in alveolar epithelial cells of each group detected by RT-PCR.圖3 RT-PCR 檢測各組肺泡上皮細胞中ENaC 的mRNA 表達水平

Figure 4.The protein levels of α-，β- and γ-ENaC in alveolar epithelial cells of each group detected by Western blot.圖4 Western blot 檢測各組肺泡上皮細胞中ENaC 的蛋白表達水平

ALI/ARDS 由于多種肺內外病因導致肺泡-微血管屏障結構破壞，肺微血管通透性增高，從而肺泡腔內富含蛋白質的大量水腫液聚集及透明膜形成，導致呼吸窘迫及頑固性低氧血癥，近10 年住院死亡率達45%［9-10］。LPS 通過激活大量的促炎癥因子啟動NF-κB 轉錄因子，釋放炎癥介質，大量中性粒細胞聚集，釋放活性氧，引起肺泡上皮-毛細血管屏障損傷和滲漏，引起肺水腫，是模擬ALI/ARDS 的常用方法［11］。本研究中通過LPS 建立小鼠ALI 模型，ALI 模型組中BALF 的總粒細胞數和中細胞數顯著增加，AFC 降低，提示肺泡-微血管屏障破壞及炎癥因子聚集，與人的ALI/ARDS病理生理表現相似。

Figure 5.The phosphorylation of SGK1 in alveolar epithelial cells detected by Western blot.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs insulin group.圖5 肺泡上皮細胞SGK1磷酸化水平

SGK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其激活依賴于羧基末端疏水基序中Ser422 通過胰島素作用PI3K信號通路的磷酸化實現［12］。本實驗中胰島素作為激活PI3K/SGK1 通路的有效途徑，同時還具有抗炎作用［13］。本實驗中胰島素的劑量不會引起血糖的較大差異的變化，這在前期研究中已經得到證實［5］。在胰島素作用后，炎癥細胞的滲出減少，AFC 增加，肺組織損傷減少。PI3KsiRNA 干預后，明顯抑制了胰島素引起的保護效應，炎癥細胞滲出顯著增加，說明胰島素激活的PI3K信號通路減輕LPS誘導的肺損傷，保護了小鼠肺組織。

AFC 被認為是排除肺泡腔內過多水腫液的有效途徑［14-15］。本研究中PI3KsiRNA 干預后，AFC 也較胰島素組顯著降低，提示PI3K 信號通路能有效促進AFC，減輕肺水腫。肺泡ENaC 是肺泡腔內鈉離子跨膜轉運，完成鈉水轉運過程的限速步驟，為排除肺泡腔內過多的水腫液提供源動力，是調節AFC 的最重要途徑和治療肺水腫的一個靶點［16-17］。ENaC 由α、β和γ 3 個亞基組成，主要表達于肺泡上皮II 型細胞。研究表明，α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC是AFC中必不可少的通道蛋白［18-19］。本研究結果顯示LPS 誘導的ALI 模型組中，α-、β-和γ-ENaC 蛋白的表達顯著下降，而胰島素治療后能顯著上調α-、β-和γ-ENaC 的蛋白表達，同時PI3K siRNA 干預后，α-、β-和γ-ENaC蛋白的表達顯著下降，其變化與AFC 一致，提示胰島素激活PI3K 信號通路與ENaC 介導的AFC 存在聯系。為進一步探討參與AFC 調節的PI3K 信號通路下游的作用靶點，我們進行了體外實驗，結果顯示，胰島素干預后，α-、β-和γ-ENaC mRNA 和蛋白表達顯著增加，其變化與胰島素誘導的SGK1磷酸化水平升高一致。PI3KsiRNA 和SGK1siRNA 分別干預后，α-、β-和γ-ENaC 的mRNA 和蛋白表達顯著降低，其變化與SGK1 磷酸化水平降低一致，說明α-、β-和γ-ENaC 表達的變化是通過PI3K/SGK1 信號通路實現的，與AFC 變化趨勢一致。 這證明了激活PI3K/SGK1 信號通路通過上調ENaC 各亞基的表達，從而促進AFC，減輕肺水腫，保護小鼠肺組織。本研究結果揭示PI3K 信號通路的下游靶點SGK1 與ENaC 的關系及在ALI/ARDS中調控AFC的分子基礎，是在我們前期研究基礎上的深入和完善［2，5］，這對明確疾病的發病機制具有實際價值。

ALI/ARDS近10年病死率居高不下，目前仍然缺乏相對有效的治療措施。本研究的結果提示激活PI3K/SGK1 信號通路通過上調ENaC 各亞基的表達，增強AFC，減輕肺組織損傷，可作為治療ALI/ARDS的潛在有效靶點，對疾病治療提供了參考資料。