淫羊藿苷通過AMPK減輕脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞線粒體損傷*

吳藝璇， 彭維艷， 劉 露， 扈臘英， 湯 磊，2， 周宇霞，2△， 郭 兵，2△

（1貴州醫科大學病理生理學教研室/貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2貴州省化學合成藥物研發利用工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025）

腎臟是高度代謝的器官，其功能與線粒體能量生成密切關聯。糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）患者常合并有脂代謝紊亂，異常的脂質蓄積會導致細胞損傷和炎癥，稱為脂毒性。其中，線粒體功能障礙介導的細胞損傷是脂質腎毒性的重要機制之一。研究表明，適度的線粒體融合和分裂是組織細胞發揮正常功能的關鍵。線粒體融合-分裂失衡在DN 的發生發展過程中起著重要作用。有證據表明，線粒體功能障礙在激活NLRP3炎癥小體中起著關鍵作用［1］。此外，線粒體過度分裂可以促進細胞凋亡［2］。同時，線粒體中脂肪酸β 氧化是早期DN 腎小管上皮細胞中活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生增加的來源［3］。因此，脂質代謝異常引起的脂質異位沉積與糖尿病腎損傷緊密關聯，過程涉及氧化應激、線粒體損傷、炎癥和凋亡等多個事件，但具體調控機制尚未充分闡明。

AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein ki?nase，AMPK）是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在ATP 被消耗，AMP 水平升高時被激活，維持能量的平衡［4-5］。目前已有研究發現，AMPK 可以促進Parkin 蛋白被招募到受損的線粒體上，并加強受損線粒體向溶酶體運動，增加線粒體自噬活性［6-7］，改善線粒體功能。

淫羊藿苷（icariin，ICA）是一種植物類黃酮苷，是中藥淫羊藿的主要活性成分。ICA 因其雌激素樣作用，對心腦血管系統、骨代謝、免疫和神經系統等具有廣泛的藥理作用，同時還具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等功效［8］。相關文獻報道，ICA 可以參與調節胰島素敏感性和脂質代謝［9-10］，降低DN 大鼠血肌酐、尿素水平，抑制腎組織膠原的合成、影響細胞外基質（extracellular matrix，ECM）積聚，發揮腎臟保護作用，因而可用于糖尿病及其相關并發癥的防治［11-12］，但其具體調控機制仍未充分闡明。因此，本文以棕櫚酸（palmitic acid，PA）培養的腎小管上皮細胞為研究對象，探討ICA 對脂肪酸誘導腎小管上皮細胞損傷的作用及可能的分子機制，為ICA 在臨床上治療DN提供實驗基礎和理論依據。

材料和方法

1 材料與試劑

淫羊藿苷（MCE）；上皮型鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-cadherin）抗體（ABclonal）；、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、p-AMPKα（Thr172）、cleaved caspase-3 抗體和MitoTracker Red CMXRos 均 為Cell Signaling Technology 產 品；Bax、Bcl-2、線粒體融合蛋白1（mitochondrial fusion protein 1，MFN1）、發動蛋白相關蛋白1（dynamin-related pro?tein 1，Drp1）、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like re?ceptor protein 3，NLRP3）、AMPK、caspase-1 及tubulin抗體均購自Proteintech；β-actin 抗體（普美生物）；含caspase 募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apopto?sis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）抗體為Santa Cruz Biotech?nology 產品；DMEM 培養基（Gbico）；胎牛血清（BI）；ROS 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自碧云天公司。AMPK 抑制劑（AMPK inhibitor，AMPKi）為dorsomor?phin，溶解于DMSO 中，母液濃度為10 mmol/L，工作濃度為10 μmol/L。

2 方法

2.1 細胞培養及分組大鼠腎小管上皮NRK52E細胞于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中培養。待NRK52E細胞融合至30%～40% 時，給予PA刺激并繼續培養48 h。根據不同的干預措施，細胞隨機分為對照（control）組、PA 組、PA+ICA 組及PA+ICA+AMP?Ki組。上述各組細胞分別處理至6孔板中，48 h后收集細胞供各指標檢測。

2.2 Western blot 檢測蛋白水平收集的細胞蛋白樣品經SDS-PAGE 分離，轉膜，用含50 g/L 脫脂牛奶的TBST 封閉液封閉1 h，TBST 洗膜3 次，孵育Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。次日回收I抗，TBST 洗膜后加入相應的Ⅱ抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜，ECL化學發光法顯色，Tanon 化學發光成像系統曝光，并使用ImageJ 軟件進行定量分析。

2.3 流式細胞術檢測細胞內ROS 的生成水平10 mmol/L DCFH-DA 稀釋于PBS 中使其工作濃度為10 μmol/L。37 ℃孵育細胞60 min 后用胰酶消化2 min，加入培養基終止消化，制成細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min收集細胞，PBS洗滌1次，離心收集細胞沉淀物用于熒光檢測。將收集好的細胞用PBS 重懸，并用流式細胞儀（ACEA NovoCyte）于激發波長488 nm處進行熒光檢測。

2.4 激光共聚焦觀察線粒體的形態變化將處理好的NRK52E 細胞吸取上清后，PBS 潤洗1 次，加入用無血清培養基配置好的MitoTracker Red（50 nmol/L）染色工作液，在37 ℃細胞孵箱中避光染色20 min。吸去染色工作液后用冰冷甲醇固定15 min，再用PBS 潤洗細胞，最后用含DAPI 的抗熒光淬滅劑封片，在激光共聚焦（Zeiss）于激發波長555 nm 處觀察線粒體形態變化，并進行統計。

2.5 倒置顯微鏡觀察細胞內線粒體膜電位變化將處理好的NRK52E 細胞吸取上清后，用PBS 潤洗1次，每孔加入JC-1 工作液1 mL，在37 ℃細胞培養箱中避光染色20 min。最后用JC-1 染色緩沖液潤洗細胞3 次，倒置熒光顯微鏡下觀察圖像。在線粒體膜電位較高時，可以產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，可以產生綠色熒光。通過JC-1 從紅色到綠色熒光的轉變可以檢測到細胞膜電位的下降。同時，設置CCCP作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism8.3 軟件進行數據統計分析。數據均以均數±標準差（mean±SD）表示，兩組數據差異的比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 ICA 減輕脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞間質纖維化

腎小管上皮細胞是通過E-cadherin 等各種細胞黏附機制來維持細胞形態、結構及功能完整性的，丟失E-cadherin 的細胞會呈現出許多非上皮細胞的特征。因此，E-cadherin 是上皮細胞黏附和表型的主要標志，其減少或丟失是EMT 重要的標志性變化。α-SMA 常于肌成纖維細胞及平滑肌細胞的胞漿中呈陽性表達，腎間質纖維化發生時，α-SMA 的表達水平增加標志著上皮細胞形態學發生了轉化。據此，我們通過Western blot 檢測NRK52E 細胞E-cadherin 和α-SMA 蛋白表達水平，探究ICA 對腎小管上皮細胞間質纖維化的影響。結果如圖1A 所示，與對照組比較，PA 組E-cadherin 的表達顯著下調（P<0.01），α-SMA 的表達顯著上調（P<0.01）。在PA 處理的細胞中加入不同濃度ICA，結果顯示2.5 μmol/L、5 μmol/L 和10 μmol/L ICA 均可顯著上調E-cadherin 的表達，同時5 μmol/L 和10 μmol/L ICA 均可下調α-SMA 的表達（P<0.05）。我們以5 μmol/L 為ICA 的最佳作用濃度行后續實驗，結果顯示：與對照組比較，PA 組E-cadherin 的表達顯著下調（P<0.01），α-SMA的表達顯著上調（P<0.01）；與PA組比較，PA+ICA 組E-cadherin的表達顯著上調（P<0.01），α-SMA的表達顯著下調（P<0.01），見圖1B。以上結果證明，ICA 可以減輕脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞間質纖維化。

2 ICA 抑制脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應

Figure 1.The effect of ICA on E-cadherin and α-SMA expression in NRK52E cells treated with PA.A：the expression of E-cadherin and α-SMA in NRK52E cells stimulated with PA after ICA intervention for 48h with different concentrations was determined by Western blot；B：after 5 μmol/L ICA intervention for 48 h，the expression of E-cadherin and α-SMA in the cells was de?termined by Western blot.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs PA group.圖1 ICA對PA處理的NRK52E細胞E-cadherin和α-SMA的影響

Bcl-2 家族成員是細胞凋亡的調控者，通過調節不同效應蛋白的表達量，調控細胞的凋亡和生長，Bcl-2 表達增多可以與Bax 形成穩定的Bcl-2-Bax 復合體，來減少Bax-Bax 復合體對線粒體膜的破壞，抑制凋亡，延長細胞壽命。細胞凋亡的數學模型認為，Bcl-2 家族中促凋亡和抑凋亡成員的比率直接決定了線粒體外膜各種通道的開放程度，形成調控細胞凋亡的樞紐。因此，Bcl-2/Bax 的比值可以作為反映細胞凋亡程度的指標。Cleaved caspase-3 是死亡受體通路、線粒體通路及其內質網應激通路的匯聚點，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC 和無活性的caspase-l 前體（pro-caspase-1）組成的多蛋白復合體，是炎癥免疫反應的重要組成部分。以NLRP3 炎癥小體為中心的NLRP3-ASC-caspase-1-IL-18/IL-1β-TGF-β 信號通路在T2DM 的發生發展過程中發揮重要作用。據此，我們通過Western blot 檢測NRK52E 細胞凋亡蛋白Bax 和cleaved caspase-3，抗凋亡蛋白Bcl-2 及炎癥小體NLRP3、ASC 和caspase-1 的蛋白水平變化，探討ICA 對腎小管上皮細胞凋亡和炎癥的影響。結果如圖2 所示，與對照組比較，PA 組Bax、cleaved caspase-3、NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白水平顯著上調（P<0.01），Bcl-2 的蛋白水平顯著下調，Bcl-2/Bax 的比值明顯降低（P<0.01）；與PA 組比較，PA+ICA 組Bax、cleaved caspase-3、NLRP3、ASC 和caspase-1 的蛋白水平顯著下調（P<0.01），Bcl-2 的蛋白水平顯著上調，Bcl-2/Bax 的比值明顯升高（P<0.01）。以上結果證明，ICA可抑制脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應。

3 ICA 抑制脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞線粒體損傷及ROS的產生

線粒體的融合可使細胞通過內補充恢復正常功能，線粒體外膜的融合主要由絲裂菌素（MFN1/MFN2）介導。線粒體分裂過程涉及關鍵發動蛋白（Drp1），隨著DN 病變的進展，線粒體的分裂與腎損傷標記物存在正相關性。據此，我們通過Western blot 檢測NRK52E 細胞MFN1 和分裂關鍵發動蛋白Drp1 的水平，進一步探究ICA 對線粒體融合和分裂的影響。結果如圖3A 所示，與對照組比較，PA 組MFN1 的蛋白水平顯著下調，Drp1 的蛋白水平顯著上調（P<0.01）；與PA 組比較，PA+ICA 組MFN1 的蛋白水平顯著上調，Drp1 的蛋白水平顯著下調（P<0.01）。為了觀察ICA 對PA 刺激的NRK52E 細胞線粒體形態的影響，我們采用MitoTracker Red 對NRK52E細胞線粒體進行染色，如圖3B所示，正常對照組NRK52E 細胞中的線粒體表現為相互交聯的網狀，在PA 刺激下轉化為短棒狀或顆粒狀，而ICA 處理組可增加線粒體的棒狀結構。以上結果證明，ICA可抑制脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞線粒體融合-分裂失衡。

Figure 2.The effect of ICA on apoptosis and inflammatory response of NRK52E cells treated with PA.A：NRK52E cells were cul?tured with PA and ICA for 48 h，and the protein levels of Bax，Bcl-2，Bcl-2/Bax，cleaved caspase-3 in NRK52E cells were determined by Western blot；B：NRK52E cells were cultured with PA and ICA for 48 h，and the expressions of NLRP3，ASC，caspase-1 in NRK52E cells were determined by Western blot.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs PA group.圖2 ICA對PA處理的NRK52E細胞凋亡和炎癥反應的影響

我們進一步采用JC-1 染色來觀察ICA 對線粒體膜電位的影響。如圖3C所示，PA刺激可以顯著誘導NRK52E細胞內線粒體膜電位的下降，表現為與正常對照組相比，PA 刺激組細胞相對熒光強度比值（紅色/綠色熒光）明顯降低；而與PA 組相比，PA+ICA 組細胞相對熒光強度比值（紅色/綠色熒光）升高。此外，我們檢測了ICA 對細胞ROS 的影響，與對照組比較，PA 組ROS 的產生水平增加，與PA 組比較，PA+ICA 組ROS 的水平降低（P<0.01），見圖3D。以上結果證明，ICA可抑制脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞線粒體損傷及ROS的產生。

4 ICA 通過激活AMPK 減輕脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞損傷

為了闡明ICA 維持線粒體功能發揮腎小管保護作用的機制，進行如下研究。

Western blot 檢 測NRK52E 細 胞p-AMPKα 和AMPK 的蛋白水平，結果如圖4A 所示。與對照組比較，PA 組p-AMPKα 的蛋白水平顯著下調（P<0.01），與PA 組比較，PA+ICA 組p-AMPKα 的蛋白水平顯著上調（P<0.01）；而AMPK 的表達在各組無顯著差異。表明ICA 可以激活AMPK 并促進其磷酸化。因此，在細胞培養基中加入10 μmol/L 的AMPK 抑制劑進一步驗證其分子機制。Western blot 結果顯示，與PA組比較，PA+ICA 組α-SMA、Drp1、NLRP3、ASC 和cas?pase-1 的蛋白水平顯著下調（P<0.01），E-cadherin 和MFN1 的蛋白水平顯著上調（P<0.01）。與PA+ICA組比較，PA+ICA+AMPKi 組α -SMA、Drp1、NLRP3、ASC 和caspase-1 的蛋白水平顯著上調（P<0.01），Ecadherin 和MFN1 的蛋白水平顯著下調（P<0.01）。以上結果證明，ICA可通過激活AMPK抑制線粒體功能損傷和炎癥反應，進而延緩脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞間質纖維化的發生發展。

討 論

Figure 3.ICA inhibited mitochondrial hyperdivision，the decrease in mitochondrial membrane potential and the production of ROS in fatty acid-induced renal tubular epithelial cells.A：NRK52E cells were cultured with PA and ICA for 48 h，and the ex?pression of MFN1 and Drp1 in NRK52E cells was determined by Western blot；B：MitoTracker staining was used to ob?serve the changes of mitochondrial morphology；C：ICA inhibited the decrease of mitochondrial membrane potential；D：ICA inhibited the production of ROS.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs PA group.圖3 ICA抑制脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞線粒體過度分裂、膜電位下降和ROS的產生

Figure 4.ICA attenuated fatty acid-induced renal tubular epithelial cell injury by activating AMPK.A：NRK52E cells were cultured with PA and ICA for 48 h，and the protein levels of AMPK and p-AMPKα in NRK52E cells was determined by Western blot；B：NRK52E cells were cultured with PA，ICA and AMPKi for 48 h，and the protein levels of E-cadherin and α-SMA in the cells were determined by Western blot；C：NRK52E cells were cultured with PA，ICA and AMPKi for 48 h，and the protein levels of Drp1 and MFN1 in the cells were determined by Western blot；D：NRK52E cells were cultured with PA，ICA and AMPKi for 48 h，and the protein levels of NLRP3，ASC，caspase-1 in the cells were determined by Western blot.Mean±SD. n=3.△△P<0.01 vs control group；**P<0.01 vs PA group；##P<0.01 vs PA+ICA group.圖4 ICA通過激活AMPK減輕脂肪酸誘導的腎小管上皮細胞損傷

血脂異常在DN 的各階段均有發生［13］。在糖尿病中，脂肪代謝紊亂使得大量脂質積累在非脂肪組織，導致脂質的異位沉積。研究表明，脂質在腎臟的異位蓄積可引起足細胞、腎小球系膜細胞和近端小管上皮細胞的結構和功能變化，導致上皮-間質轉分化和細胞外基質沉積等，最后致腎實質破壞和腎功能喪失。線粒體功能障礙介導細胞損傷是導致糖尿病腎病腎小管損傷的關鍵因素之一。其中，線粒體融合和分裂在維持線粒體穩態平衡中發揮重要作用［14］。線粒體分裂可以影響線粒體自噬和細胞凋亡，但分裂過程改變了線粒體膜電位，繼而削弱了ATP 的生成。線粒體融合可使細胞恢復正常功能，線粒體嵴數量增多，高效產生ATP，維持細胞生存［15-16］。AMPK 是參與生物能量代謝調節的關鍵因子。 據報道，糖尿病或肥胖癥患者其腎組織中AMPK 表達減少；在1 型和2 型糖尿病模型鼠中，腎臟AMPK 的活性均受到抑制而AMPK 激活劑可以逆轉糖尿病腎臟損傷［17］。研究表明，當細胞內AMP/ATP 的比值升高時AMPK 被激活，通過增強過氧化物酶體增殖活化受體γ 輔助活化因子1α 的轉錄活性，從而調控線粒體的生物合成和能量代謝，促進脂肪酸氧化［18-19］。線粒體既是細胞內ROS 產生的主要來源，同時又容易受到ROS 的攻擊［20］。細胞內大約90% ROS 的產生來源于損傷的線粒體［21-22］。ROS 的產生增加可以誘導線粒體分裂，而線粒體分裂也可以促進ROS 產生［23］。有證據表明，損傷線粒體釋放的ROS 可以促進NLRP3 蛋白的去泛素化，從而導致NLRP3炎癥小體的激活［1］。

淫羊藿含有ICA 等黃酮類及木脂素類、苯酚苷類等多種組分［24］。其藥理成分復雜并具有廣泛的生物活性［25］。近年來，ICA對各種代謝性疾病的治療作用已引起學者們的重視［26］。在鏈脲菌素誘導的糖尿病大鼠模型中，ICA能有效降低血液中血脂及果糖水平，同時延緩鏈脲菌素誘導的糖尿病視網膜病變［27］及糖尿病腎病的發生［28］。研究表明，ICA可通過誘導PGC-1α的表達激活AMPK，促進脂肪酸氧化，增加能量生成；可通過激活AMPK 抑制ROS 的產生，改善心肌細胞內外Ca2+和ATP 酶的活性，提高能量利用，從而發揮治療心力衰竭的作用。但ICA 對糖尿病腎病的保護作用，其機制有待進一步闡明。我們研究發現，脂肪酸刺激下腎小管上皮細胞間質纖維化相關蛋白、凋亡蛋白、線粒體損傷蛋白和炎癥因子的表達顯著升高，ROS 的產生水平增加，線粒體過度分裂和線粒體膜電位下降，而ICA 能夠逆轉上述改變。然而，AMPK抑制劑的干預可以削弱ICA對脂肪酸刺激腎小管上皮細胞損傷的作用。AMPK 由一個催化亞單位α和兩個調節亞單位β、γ構成［29］，通常α亞基的172 位蘇氨酸磷酸化具有激活形式。目前介導172位蘇氨酸磷酸化的上游激酶有LKB1，CaMKKβ 及TAK1等［30］。而我們前期實驗發現ICA可促進AMPK的磷酸化，但是否通過上述3 種激酶或其它方式發揮作用，尚有待進一步研究。

綜上所述，ICA減輕脂肪酸所致腎小管上皮細胞的損傷，可能是通過激活AMPK 維持線粒體融合-分裂穩態及抑制ROS生成、炎癥反應和細胞凋亡有關。不足的是，本研究未在動物水平闡明ICA 對DN 腎小管線粒體損傷的作用機制，仍有待進一步研究。