3種致病菌多重real-time PCR檢測方法的建立及其在散裝即食肉制品中的應用

范 維，高曉月，李賀楠，董雨馨，李宇軒，劉虹宇，郭文萍

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，北京 100068）

隨著人們膳食習慣的改變，食品生產加工模式和銷售方式也發生了變化，即食食品由于方便、快捷等優點已成為廣大消費者推崇的快銷食品[1-2]。此類食品主要是指不需要額外加工處理即可食用，該類食品或是未經烹煮或已經煮熟、燙熱或冰凍，無需再經加熱處理（包括翻熱）[3]。即食食品較為常見的銷售形式為散裝銷售，散裝即食食品因略去繁瑣的包裝，買賣隨意方便，降低了食品的成本，倍受消費者和生產者的青睞。但是由于散裝即食食品的制作、銷售過程中，銷售者與食品的接觸以及食品與空氣的接觸，導致微生物性“二次污染”的可能性加大，增加了散裝即食食品的致病菌污染風險，特別是熟肉制品、涼拌菜等[4-5]。目前，針對散裝即食食品國家衛生健康委員會已經擬訂了《散裝即食食品中致病菌限量》標準草案，該草案中對散裝即食食品中需檢測的致病菌以及各致病菌的限量提出了明確要求，其中熱處理散裝即食食品要求檢測的致病菌有沙門氏菌（Salmonella，SAL）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，BC）3種。對于這3種致病菌的檢測，傳統的微生物檢測和鑒定方法一般要經過增菌培養、分離純化、生化鑒定和血清學驗證等多個步驟，檢測周期長，操作繁瑣[6-7]；免疫學檢測技術存在靈敏度偏低、檢測通量小等缺點[8]；生物傳感器技術[9]、質譜技術[10-11]成本較高，需要專業人員操作，不易在基層普及推廣。因此，建立一種高通量、準確、快速的致病菌檢測方法顯得尤為重要。

多重實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術因其在檢測通量、時效性、靈敏度以及成本方面的優勢得到迅速發展[12-13]。Elisa等[14]利用三重real-time PCR方法實現了肉制品中SAL、大腸埃希氏菌O157:H7和單核細胞性李斯特菌3種食源性致病菌的同時檢測。Qin Hong等[15]利用多重real-time PCR技術實現對牛奶中單核細胞性李斯特菌、坂崎克羅諾桿菌、SA的檢測。李濤等[16]利用多重realtime PCR技術實現對海產品中霍亂弧菌、副溶血性弧菌和單核細胞性李斯特菌的快速檢測。但目前對于采用多重TaqMan探針real-time PCR技術同時定量檢測肉制品中SAL、SA和BC的研究較少。因此，本研究旨在建立一種高通量、快速、準確、靈敏的SAL、SA和BC三重realtime PCR檢測方法，以應用于市場上散裝即食肉制品的檢驗，為監管部門進行散裝即食食品病原微生物風險監測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌種

實驗采用散裝即食肉制品指熟的純肉制品，例如醬牛肉、醬肘子、烤羊腿肉、熏鴨肉、熏雞胸肉等，購自超市、門市店或農貿市場。

菌株共有27 株，包括SAL 6 株、SA 3 株、BC 3 株、非目標菌株15 株，保存于-80 ℃冰箱。其中SA（ATCC 25923）、鴨沙門氏菌（ATCC 9270）、BC（ATCC 8187）、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、伊氏李斯特氏菌（ATCC 19119）、產氣莢膜梭菌（ATCC 13124）、志賀菌（ATCCA 9207）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、產氣腸桿菌（ATCC 13048）、英諾克李斯特氏菌（ATCC 33090）、副溶血性弧菌（ATCC 17802） 美國模式培養物集存庫；鼠傷寒沙門氏菌（CGMCC 1.1190）、SA（CGMCC 1.0089）、表皮葡萄球菌（CGMCC 1.2429）、弗氏檸檬酸桿菌（CGMCC 1.1732） 中國微生物菌種保藏中心；甲型副傷寒沙門氏菌（CICC 24167）、腸炎沙門氏菌（CICC 21482）、嬰兒沙門氏菌（CICC 21481）、乙型副傷寒沙門氏菌（CICC 10437）、BC（CICC 10041）、SA（CICC 10384）、阪崎腸桿菌（CICC 21544）、熒光假單胞菌（CICC 21620） 中國工業微生物菌種保藏中心；BC（CMCC 63303）、單核細胞性李斯特菌（CMCC 54002）、枯草芽孢桿菌（CMCC 63501）、普通變形桿菌（CMCC 49027） 中國醫學微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

營養瓊脂（nutrient agar，NA）、腦心浸液肉湯（brain heart lnfusion，BHI）、胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）、緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、李氏增菌肉湯（listeria enrichment broth base，LB）、7.5%氯化鈉肉湯（7.5%鹽）、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯（trypticase soy polymyxin broth base，TSPBB） 北京陸橋技術有限責任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 廣州迪澳生物科技有限公司；2×PCR Premix ExTaqTM大連寶生物科技有限公司；引物、探針合成 上海英濰捷基科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FTC3000熒光定量PCR 加拿大楓嶺科技有限公司；DHP-9272恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；TD4低溫高速離心機 鑫港儀器有限公司；SterilGARD III Advance 生物安全柜 美國貝克公司。

1.3 方法

1.3.1 引物與TaqMan探針設計與合成

根據GenBank中登錄的SALinvA基因、SASa442基因和BCCereolysin AB基因的保守序列，應用Priemer Express和Primer Premier 5.0軟件進行引物和探針設計，再通過GenBank中的BLAST以及Snapgene軟件驗證引物和探針的可行性，具體序列見表1。

表1 實驗所用引物及TaqMan探針序列Table 1 Primers and TaqMan probes used in this study

1.3.2 細菌的培養及模板DNA提取

考察不同增菌液對3種目標菌同時增菌的效果。將3種目標菌分別接種于BHI肉湯中，36 ℃培養24 h，各取1 mL進行10 倍遞增稀釋（10-1～10-8），并選擇適當稀釋濃度進行傾注平板計數。將10-8稀釋水平的3種菌懸液進行等體積混合后，分別用5 種常見的前增菌液（TSB、BPW、LB、7.5%鹽和TSPBB）于36 ℃條件下，對混合菌懸液進行5 h前增菌。通過對比5 種增菌液中3種目標菌的比生長速率衡量其增菌效果。菌種比生長速率按下式計算。DNA的提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒，按照說明書進行，將DNA模板凍存于-20 ℃備用。

式中：μ為菌種比生長速率/%；N1和N2分別為t2/h、t1/h對應的菌落總數/（CFU/mL）。

1.3.3 多重real-time PCR體系及擴增條件

反應體系為50 μL：25 μL 2×PCR Premix ExTaqTM，3種探針（10 μmol/L）各1.0 μL，3種上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板3.0 μL，補水至50 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環，在每個循環延伸階段收集熒光信號。陽性結果判定：Ct值不大于40且擴增曲線呈S型。

1.3.4 特異性實驗

提取12 株目標菌株和15 株非目標菌株的DNA，并以此為模板，分別進行SAL、SA、BC三重real-time PCR實驗，以檢測本方法的特異性。

1.3.5 標準曲線及敏感性實驗

將經活菌計數的SAL 2416、SA 25923、BC 8187菌液，分別進行10 倍梯度稀釋至10-7，各取1 mL進行DNA提取。將提取后的3 株菌的DNA，依據同級別濃度梯度分別進行等體積混合，以混合后的DNA為模板進行realtime PCR擴增，以濃度的對數為橫坐標，Ct值為縱坐標制作標準曲線。

1.3.6 重復性實驗

參考張靜等[17]的方法，分別在2 批次菌株培養液梯度稀釋樣本中選取3個梯度（103、104、105CFU/mL），用2 批次試劑進行多重real-time PCR檢測，每一梯度重復檢測5 次，每次2個平行，計算Ct值的組間和組內變異系數以評估其重復性和穩定性。

1.3.7 多重real-time PCR方法檢出限

考察不同肉基質樣品的檢出限。對比樣品不經過增菌和經過5 h增菌后進行多重real-time PCR檢測，2 種前處理方法檢出限的差異，具體做法如下：取經驗證不含3種目標致病菌的5 種即食肉制品（豬、牛、羊、雞、鴨）樣品各40 份（每份25 g），每種源性樣品平均分成4 組，向其中加入225 mL增菌液，均質1 min。之后將活化好的菌懸液加入250 mL體系中，使體系中3種目標菌（SAL 2416、SA 25923、BC 8187）的終濃度分別達到100、101、102、103CFU/mL，充分混勻。每組中取5 份樣品直接進行多重real-time PCR檢測；另5 份樣品于37 ℃恒溫培養箱增菌5 h后，進行多重real-time PCR檢測。

1.3.8 實際樣品檢測

從不同超市、門市店及農貿市場購買即食肉制品樣品100 份，包括豬肉制品（20 份）、牛肉制品（20 份）、羊肉制品（20 份）、雞肉制品（20 份）、鴨肉制品（20 份），為了保證一定的檢出率，對其中40 份樣品進行目標菌人為污染，具體樣品信息見表2。取各樣品25 g添加225 mL增菌液制備250 mL體系，充分混勻后，于37 ℃恒溫培養箱增菌5 h。之后取1 mL增菌液進行DNA提取及多重real-time PCR檢測。同時采用GB 4789.4—2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》[18]、GB 4789.10—2016《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[19]及GB 4789.14—2014《食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》[20]對樣品中的SAL、SA和BC分別進行檢測，對比2 種方法的檢測結果。

表2 40 份人為污染肉制品樣品信息及檢測結果Table 2 Results of real-time PCR and national standard method for 40 artificially contaminated meat samples

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 引物、TaqMan探針可行性及特異性驗證結果

從NCBI獲取SAL、SA和BC的基因組序列，使用Snapgene軟件打開基因組序列，并將設計的引物、探針導入Snapgene軟件中，對其可行性進行分析，結果見圖1。由圖1A～C可知，所設計的3 組引物、探針分別可以在各自對應的目標菌基因組序列中搜索到，說明3 組引物探針可以用于SAL、SA和BC的real-time PCR檢測。此外，通過對27 株目標菌和非目標菌進行多重realtime PCR檢測發現，只有相對應的目標菌株出現“S型”陽性擴增曲線，其他非目標菌株均未出現。說明針對這3種致病菌建立的多重real-time PCR方法具有較好的特異性，與其他食源性致病菌存在交叉反應的概率較小，結果見圖1D。

圖1 引物、TaqMan探針可行性及特異性分析Fig. 1 Feasibility and specificity analysis of primers and TaqMan probes

2.2 增菌液的確定

為了選出一種增菌液可以使3種目標菌均達到較好的增菌效果，本研究通過對比3種目標菌在不同增菌液中的比生長速率，確定最佳增菌液，結果見圖2。BPW、LB、7.5%鹽和TSPBB分別為GB 4789.4—2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》[18]、GB 4798.30—2016《食品微生物學檢驗 單細胞增生李斯特氏菌檢驗》[21]、GB 4789.10—2016《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》、GB 4789.14—2014《食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》[20]中規定的SAL、單核細胞性李斯特菌、SA和BC的增菌液。BC在LB和7.5%鹽增菌液中，經過5 h培養后并沒有生長，比生長速率為0；SAL和BC在TSB、BPW、TSPBB增菌液中的增菌效果相似（P＞0.05）；而SA在TSB和7.5%鹽增菌液中增菌效果較好（P＜0.05）。綜上，選取TSB作為3種目標菌的增菌液。

圖2 不同增菌液增菌效果Fig. 2 Efficiencies of different enrichment solutions

2.3 多重real-time PCR方法敏感性實驗結果

以Ct值為縱坐標（y），菌液濃度的對數為橫坐標（x）繪制標準曲線，結果如圖3所示。由圖3B～D可知，SAL 2416的標準曲線在3.8×102～3.8×108CFU/mL濃度范圍內具有良好的線性相關性（y=-3.300 0x+43.587，R2=0.998 3），SA 25923的標準曲線在4.9×102～4.9×108CFU/mL濃度范圍內具有良好的線性相關性（y=-3.631 8x+44.592，R2=0.995 7），BC 8187的標準曲線在5.7×102～5.7×108CFU/mL濃度范圍內具有良好的線性相關性（y=-3.516 1x+43.073，R2=0.998 7）。由此可知，多重real-time PCR法定量下限分別為3.8×102、4.9×102CFU/mL和5.7×102CFU/mL。而當3種目標菌的濃度低于該檢出限時，仍有擴增（Ct=35～40），但不呈線性關系，且重復性和準確性差。

圖3 3種目標菌擴增曲線及標準曲線Fig. 3 Amplification curves and standard curves for three target bacteria

2.4 重復性實驗結果

如表3所示，SAL、SA、BC的批內和批間變異系數均小于2%，表明本方法具有良好的重復性。

表3 多重real-time PCR方法的重復性檢驗結果Table 3 Reproducibility of multiple real-time PCR

2.5 多重real-time PCR方法檢出限

以豬、牛、羊、雞和鴨5 種純肉制品作為基質，對比樣品不經過增菌和經過5 h增菌，這2 種前處理方法多重real-time PCR檢出限的差異。從結果可知，不同純肉基質對目標菌的檢出限影響較小，這與Fereidoun[22]、Yang Youjun[23]和Suo Biao[24]等的研究結果一致，且SN/T 1059.7—2010《進出口食品中沙門氏菌檢測方法 實時熒光PCR法》[25]中對于不同食品基質，SAL的檢出限相同。此外，通過對不同加標濃度樣品檢測證明，2 種前處理方法多重real-time PCR的檢出限不同：未增菌組，5 種基質中SAL、SA、BC的檢出限分別為3.8×102、4.9×102CFU/mL和5.7×102CFU/mL；增菌組，檢出限分別為3.8、4.9 CFU/mL和5.7 CFU/mL。該檢出限結果較Paola[26]、李新福[27]等的研究低，說明本方法更為靈敏；與李慧芳[28]和Elisa等[14]的研究結果相似，但增菌時間（5 h）較短（12 h或18 h），可能是優化了前增菌液的原因。

2.6 實際樣品檢測結果

采用本方法與國標方法同時對100 個實際樣品（包括40 個人為污染樣品和60 個自然樣品）進行檢測，其中除了人為添加的40 個樣品檢出目標菌外，還有1個自然樣品檢出SAL，2個自然樣品檢出SA。總體上，2 種方法的檢測結果一致（表2、4），說明所建方法結果可靠，可以用于即食肉制品中3種致病菌的檢測。

表4 不同方法檢測即食肉制品中SAL、SA、BC的陽性檢測結果Table 4 Positive detection rates of SAL, SA and BC in ready-to-eat meat products determined by different methods

3 結 論

本研究建立即食肉制品中SAL、SA和BC的三重TaqMan探針real-time PCR檢測方法，實現在一個反應管中同時擴增3種目標菌，達到了縮短檢測時間、提高檢測效率的目的。TaqMan探針法由于只能結合特定的擴增子，因此較SYBR-Green染料法具有更好的特異性，無需再借助熔解曲線分析鑒定PCR的單峰[29-30]。通過對12 株目標菌和15 株非目標菌進行特異性驗證，發現本方法具有良好的特異性，15 株非目標菌均無典型擴增曲線，且對6 種（SAL 9270、1.1190、24167、21482、21481、10437）同屬但不同血清型的SAL均可檢出。此外，該方法還具有較高的靈敏度和重復性，即食肉制品樣品中的檢出限可達100CFU/mL水平，滿足各標準中對3種目標菌限量值的要求，且定量檢測批內和批間的變異系數均小于2%。對100 份即食肉制品實際樣品進行檢測均與國家標準檢測的結果符合，且該方法從前增菌到多重realtime PCR檢測完成僅需7 h，遠低于國標方法（檢測周期為2～6 d）。綜上，本研究建立的三重TaqMan探針realtime PCR檢測方法可以作為一種可靠地檢測手段，為監管部門進行散裝即食肉制品中病原微生物風險監測提供技術支持。