小麥酯酶電化學生物傳感器構建及其對敵敵畏的檢測

劉 豐，田運霞，吳遠根，陶 菡

（貴州大學釀酒與食品工程學院，發酵工程與生物制藥省重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

目前，食品中農藥殘留超標的問題非常普遍和嚴重，尤其以糧食、果蔬等農產品為主，由此帶來的食品安全問題是公共健康面臨的最主要威脅之一[1-2]。因此，農殘的監控和檢測成為各國政府和民眾強烈關注的問題。

農藥檢測當前基本依賴于大型儀器分析技術，如色譜、色譜-質譜聯用、光譜等[3-5]，以上方法檢測通量大、靈敏度高，但儀器昂貴、操作復雜、攜帶不方便，而且需要比較復雜的前處理過程，檢測時間較長，所以應該開發出快速、準確且低成本的檢測方法。相比而言，電化學傳感技術不僅具有靈敏度高、操作簡便快速、成本低等優點[6-7]，而且可以開發成便攜式檢測儀實現田間或農貿市場的實時檢測[8-9]。因此，電化學農殘檢測技術近年來受到了廣泛關注[10-11]。

基于農藥對酶生物活性的抑制可以實現農藥的快速檢測[12]。目前用于農藥檢測的酶主要是乙酰膽堿酯酶（EC 3.1.1.7），其來源于動物，提取工藝繁瑣，原材料珍貴，成本高[13]。近年來研究發現來源于植物的酯酶（EC 3.1.1.X）具有與乙酰膽堿酯酶相似的作用機理，其酶活也可以被農藥所抑制且其對農藥的敏感性不遜于膽堿酯酶[14-15]。此外，植物酯酶存在于各種農作物中，來源十分豐富，提取方法簡單，價格也更加低廉[16]，且對酶的保存條件不像膽堿酯酶那樣苛刻。因此采用植物酯酶代替乙酰膽堿酯酶測定農藥殘留將會是一種更經濟實用的方法，具有良好的開發應用價值。

基于此，本研究以小麥酯酶（plant-esterase from wheat flour，wPLaE）為酶源，構建基于酶抑制作用的電化學農藥檢測技術。同時，借助多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWNT）和納米金（gold nanoparticles，AuNPs）的協同電催化效應增敏傳感信號，實現了有機磷農藥敵敵畏的準確、低成本檢測。目前鮮見基于wPLaE結合AuNPs/MWNT納米材料用于農藥檢測的相關研究報道。本實驗擬構建可用于有機磷農藥檢測的新型電化學酶傳感器NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE，以期為植物酯酶在電化學傳感領域的應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥、大米、生菜購于當地農貿市場。

殼聚糖（chitosan，CS）、PEG 1000、硫酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、濃硫酸、硝酸、檸檬酸鈉、HAuCl4、乙醇、檸檬酸、葡萄糖（均為分析純）和Nafion 117溶液 上海阿拉丁試劑有限公司；敵敵畏標準品、溴氰菊酯標準品、多菌靈標準品、林丹標準品、1-乙酸萘酯（1-naphthyl acetate，1-NA）（分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；Al2O3打磨粉 上海辰華有限公司；MWNT 先豐納米有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

CHI660E電化學工作站 上海辰華儀器有限公司；A-10超純水儀 美國Milipore公司；SB-5200 DTD超聲清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；S-3400N掃描電鏡 日本日立公司；3K18離心機 德國Sigma公司；BSA124S-CW電子天平（可讀精度0.000 1 g）德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 wPLaE的提取與純化

小麥洗凈晾干后粉碎，稱取適量小麥粉，按照1∶5（g/mL）比例加入蒸餾水，攪拌30 min，4 ℃浸提過夜，離心取上清液，即得到植物酯酶粗酶液。參照文獻[17]進行雙水相萃取，得到純化后的wPLaE，冷凍干燥成粉末，儲存于-20 ℃備用。

1.3.2 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）配制

先分別配制0.2 mol/L Na2HPO4溶液（A液）和0.2 mol/L NaH2PO4溶液（B液），取315 mL A液和685 mL B液混合均勻得pH 6.5的PBS。取720 mL A液和280 mL B液混合均勻得pH 7.2的PBS。

1.3.3 MWNT酸化

將1 g MWNT用80 mL濃硫酸與硝酸（H2SO4∶HNO3=3∶1，V/V）的混合物在80 ℃回流180 min，對納米碳管進行羧基化，離心，棄上層懸浮液，然后水洗至pH值近中性，將產物在65 ℃真空干燥。

1.3.4 AuNPs的制備

150 mL超純水攪拌加熱至沸騰，迅速加入4.5 mL 1%的檸檬酸鈉溶液與1.5 mL 1%的HAuCl4溶液，繼續反應至溶液顏色變為酒紅色，繼續沸騰15 min后停止加熱，繼續攪拌至冷卻[18]。將AuNPs溶液儲存于棕色瓶中，4 ℃貯存備用。

1.3.5 酶電極的制備

將玻碳電極（glassy carbon electrodes，GCE）用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末打磨并拋光至鏡面，然后依次用水、乙醇、超純水超聲清洗，在PBS（0.2 mol/L、pH 7.2）中活化后備用。首先在GCE表面滴加6 μL 0.5 mg/mL的MWNT溶液，室溫晾干后，依次向電極表面滴加6 μL AuNPs和24 μL wPLaE-CS混合液，最后取4 μL Nafion（質量分數0.1%）滴涂在電極表面，制成NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE。

1.3.6 電化學測試

采用三電極檢測裝置：修飾GCE為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl為參比電極。以PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）溶液為測試底液，將制備好的電極首先在含有0.8 mmol/L 1-NA的PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）中進行方波伏安（square wave voltammetry，SWV）檢測得電流值I0，電極清洗后，將電極浸入不同質量濃度的敵敵畏標準液中孵育10 min，再次將其浸入含有同濃度底物的PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）中進行SWV檢測得電流值I1，根據下式計算抑制率Y：

1.3.7 實際樣品的制備

稱取25 g（精確至0.000 1 g）生菜樣品，加入100 mL PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）粉碎至漿，然后將生菜勻漿在8 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，稀釋20 倍后作為生菜汁實際樣品。

大米磨至粉末，過80 目篩，稱取0.03 g（精確至0.000 1 g）大米粉與100 mL PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）混合均勻，并在8 000 r/min離心30 min，離心后取0.2 mL上清液用20 mL超純水稀釋作為大米實際樣品。

2 結果與分析

2.1 納米材料表征

如圖1a所示，MWNT呈細長的管狀，直徑在30 nm左右，且多個管狀結構堆疊纏繞形成中空的網狀結構，該結構可為后續材料的修飾提供更多的附著位點。

如圖1b所示，紫外-可見光譜在518 nm波長處有最大吸光度，根據文獻報道[19]，不同粒徑、不同濃度的AuNPs有不同的特征峰與最大吸收波長，且AuNPs的最大吸收波長與其粒徑呈線性相關：λ=0.786D+505.53，其中λ為最大吸收波長，D為AuNPs的粒徑，通過計算得到AuNPs的粒徑為（15±2）nm，與透射電鏡圖基本一致。

圖1 MWNT和AuNPs電鏡圖Fig. 1 Electron microscopic images of MWNT and AuNPs

2.2 酶電極修飾過程的電化學表征

在5 mmol/L的鐵氰化鉀探針溶液中對電極的修飾過程進行循環伏安（cyclic voltammetry，CV）法表征，結果如圖2所示，在-0.2～0.6 V區間，所有電極都出現了一對氧化還原峰，對應的反應歷程為[Fe(CN)6]3-+e=[Fe(CN)6]4-。與裸電極（曲線a）相對比，修飾MWNT之后（曲線b）氧化還原峰電流明顯增加，這說明MWNT具有良好的導電性和電催化活性，能夠促進電子傳遞；繼續修飾AuNPs后（曲線c），響應電流又出現小幅度提升，這得益于AuNPs的良好導電性。而在修飾了wPLaE和Nafion后（曲線d），電極的響應電流值明顯減小，這是因為wPLaE為蛋白質，導電性能差，因而阻礙了電子的傳遞。圖2表明wPLaE被成功地修飾于電極上，且修飾后的電極比裸電極具有更好的電化學響應。

圖2 不同修飾電極在探針溶液中的CV曲線圖Fig. 2 CV curves of different modified electrodes in probe solution

2.3 傳感電極對1-NA的酶催化電化學響應

采用CV技術考察wPLaE對其底物1-NA的電化學響應，結果如圖3所示。修飾了wPLaE的傳感器在不含底物1-NA的溶液中無任何峰出現（曲線b），加入1-NA后在0.55 V附近出現了一個明顯的氧化峰（曲線c），這是wPLaE水解底物1-NA生成了具有電化學活性的1-萘酚，隨后1-萘酚被電化學氧化產生相應的氧化峰，反應歷程如圖4所示。曲線a為無wPLaE的傳感器在PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）底液中的CV圖，發現無任何氧化還原峰出現，進一步證明曲線b中的氧化峰就是wPLaE催化1-NA所致。以上現象表明wPLaE被成功固載在電極上且保持了其酶催化活性。

圖3 不同修飾電極的CV圖Fig. 3 CV curves of different modified electrodes

圖4 酶催化反應（a）和1-萘酚氧化反應（b）Fig. 4 Enzyme catalyzed reaction (a) and oxidation reaction of 1-naphthol (b)

考察3種不同酶電極對同一濃度1-NA的電化學響應（圖5）。實驗發現，電極上沒有修飾納米材料時只出現了很小的一個氧化峰（曲線a）。修飾MWNT后，該氧化峰有所增大，繼續修飾AuNPs后氧化峰明顯增大且峰電位負移，這表明AuNPs和MWNT具有協同電催化效應，能有效地促進電子轉移，從而對wPLaE的生物催化電化學響應有顯著增敏作用。此外，AuNPs具有良好的生物相容性[20]，這有利于保持電極上wPLaE的生物活性。

圖5 不同修飾電極在含0.8 mmol/L 1-NA的PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）中CV曲線Fig. 5 CV curves of different modified electrodes in PBS (0.2 mol/L,pH 6.5) containing 0.8 mmol/L 1-NA

2.4 敵敵畏對酶催化響應信號的影響

圖6NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE在不同條件下的CV曲線Fig. 6 CV curves of NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE under different conditions

考察敵敵畏對電極上wPLaE生物催化活性的影響。由圖6可知，酶電極在未加入底物1-NA的空白PBS中未出現氧化峰（曲線a），加入底物1-NA后，出現了明顯的電化學氧化峰（曲線b），用80 μg/L敵敵畏農藥作用后，氧化峰電流的響應值減小（曲線c），以上實驗現象說明敵敵畏可以抑制wPLaE的活性，使得體系中生成的1-萘酚的量減少，從而導致1-萘酚氧化峰響應電流也隨之減小，據此可以建立基于酶抑制作用的敵敵畏農藥檢測新技術，檢測原理如圖7所示。

圖7 敵敵畏檢測原理示意圖Fig. 7 Schematic illustration of the principle of dichlorvos detection

2.5 敵敵畏檢測標準曲線的建立

如圖8所示，隨敵敵畏質量濃度增加，峰電流值減小，即隨敵敵畏質量濃度增加，對wPLaE活性的抑制作用也增強。結果表明在10～100 μg/L范圍內，敵敵畏質量濃度（C）與抑制率（Y）之間呈良好的線性關系，線性回歸方程為Y=0.778C+6.248，R2=0.995，檢出限為4 μg/L（RSN=3）。

圖8 不同質量濃度敵敵畏作用后的SWV圖Fig. 8 SWV curves after treatment with different concentrations of dichlorvos

2.6 重復性和穩定性結果

同一支電極測定5 次0.8 mmol/L 1-NA，峰電流值的相對標準偏差為3.3%（n=5）。此外，同一批制備的5 支電極，分別測定0.8 mmol/L 1-NA，峰電流值的相對標準偏差為5.3%（n=5）。

考察所制酶電極的穩定性，每隔5 d對同一濃度的1-NA進行測試，不用時放在4 ℃避光保存。結果表明，第5天響應電流值減小為初始電流值的93%；第10天響應電流值降至88%；第15天仍保持初始電流值的78%，說明制備的酶電極具有良好的穩定性。

2.7 抗干擾性實驗結果

考察實際樣品中可能共存的常見離子、有機物和其他類型農藥對測定的影響，結果如圖9所示（以只有敵敵畏時的響應信號為100%）。結果表明，3 mg/L的Cl-、檸檬酸和葡萄糖與30 μg/L敵敵畏共存時，響應信號沒有明顯改變，說明所建方法具有良好的抗干擾能力。但當300 μg/L的Pb2+與30 μg/L的敵敵畏共存時，響應信號降低為原來的63%，說明Pb2+也能抑制wPLaE活性，對測定有干擾。此外，30 μg/L的林丹（有機氯類農藥）和溴氰菊酯（擬除蟲菊酯類農藥）共存對測定幾乎無干擾，但30 μg/L多菌靈（氨基甲酸酯類農藥）共存時，響應信號明顯下降，表明其對wPLaE活性有抑制。但同樣的抑制作用也在其他植物酯酶型和乙酰膽堿酯酶型傳感器中出現。

圖9 NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE傳感器的抗干擾性Fig. 9 Anti-interference ability of NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE

2.8 與其他方法比對結果

對所建方法與近年來其他方法進行比較。由表1可知，所建方法具有較低的檢出限。此外，雖然本法的檢出限仍高于超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜，但與昂貴的大型儀器相比，本法的具有儀器便宜、操作簡單，樣品無需預處理的優勢。

表1 本法與其他敵敵畏檢測方法比較Table 1 Comparison of this method with other dichlorvos detection methods

2.9 方法的回收率和精密度實驗結果

采用NF/WPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE傳感器對實際樣品（生菜和大米）中敵敵畏的檢測性能進行考察。在實際樣品中添加不同質量濃度的敵敵畏進行檢測，每組實驗平行測定3 次。從表2可以看出，對敵敵畏的檢測回收率在95.4%～107.2%之間，具有良好的回收率，表明該傳感器可以用于實際樣品中敵敵畏檢測。

表2 NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE實際樣品中敵敵畏檢測結果Table 2 Recoveries and precision of dichlorvos spiked in real samples with NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE

3 結 論

以來源于植物的wPLaE代替來源于動物的乙酰膽堿酯酶為酶源，構建了一種新型生物傳感電極NF/wPLaECS/AuNPs/MWNT/GCE，將其用于農藥敵敵畏的簡便、準確檢測，檢出限為4 μg/L（RSN=3）。該生物傳感電極具有良好的穩定性，這得益于AuNPs和CS良好的生物相容性及植物酯酶自身較好的穩定性。與大型儀器分析方法相比，所建電化學檢測方法具有簡便、準確、快速、樣品預處理簡單等優點。該研究也可為食品中農殘電化學傳感器的實際應用開發和后續便攜式電化學傳感器的研發提供一定的理論和技術基礎。