恒溫隔絕式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測食品中金黃色葡萄球菌

李傳友，曾寶鋒，趙燕英，湯 承，陳 娟，劉 驥，朱成林，曾英杰，于基成，唐俊妮,*

（1.西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；3.大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，沈陽 大連 116600）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）廣泛存在于自然界，是一種常見的食源性致病微生物[1]。其容易污染食物并在食物上生長產(chǎn)生具有毒性的腸毒素物質(zhì)（Staphylococcal enterotoxins，SEs），如SEA、SEB、SED等經(jīng)常引發(fā)食物中毒，威脅著食品安全[2-3]。人體是金黃色葡萄球菌的天然宿主，30%～50%健康人體的鼻腔中定植有金黃色葡萄球菌[4]，因此，食品從生產(chǎn)加工到最終的銷售環(huán)節(jié)都有被污染的可能。每年因金黃色葡萄球菌污染食物而引發(fā)的食物中毒事件時有發(fā)生，如陳永正等[5]對一起幼兒園食物中毒事件展開調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該起食物中毒事件由金黃色葡萄球菌A型腸毒素引起；熊玉華等[6]對一家自助餐廳的食材進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)從不同食材中都能分離出金黃色葡萄球菌。

目前，金黃色葡萄球菌的常用檢測方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)檢測方法等[7-9]。其中傳統(tǒng)檢測方法和免疫學(xué)方法都存在耗時長，操作繁瑣等缺點[10]。分子生物學(xué)作為最常用的一種檢測方法，具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛用于金黃色葡萄球菌的檢測中[11]。

恒溫隔絕式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（insulated isothermal polymerase chain reaction，iiPCR）是一種新型熒光PCR技術(shù)，它是根據(jù)Rayleigh-Benard對流原理，通過反應(yīng)管底部液體持續(xù)加熱產(chǎn)生上部液體與下部液體的溫度差，通過控制散熱的速率與對流的時間，在反應(yīng)管內(nèi)部形成穩(wěn)定溫度梯度，從而提供PCR擴(kuò)增所需的反應(yīng)條件[12]。該技術(shù)最早在2002年，由Krishnan首次報道[13]，結(jié)合POCKITTM系列手持式核酸檢測儀，體積小、自帶電源，加樣后一鍵操作，反應(yīng)僅需42 min便可完成，結(jié)果以“+”、“-”、“?”直接顯示于液晶屏幕上，方便快捷，可達(dá)到現(xiàn)場快速檢測的目的。目前iiPCR技術(shù)主要用于病毒檢測，如豬流行性腹瀉病毒[14]、牛冠狀病毒[15]、蝦白斑病病毒[16]、尖孢鐮刀菌[17]、滑膜支原體[18]等；而針對細(xì)菌的檢測報道較少，僅有無乳鏈球菌[19]和沙門氏菌[20]的相關(guān)報道。因此，本研究擬建立一種基于iiPCR技術(shù)快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，并進(jìn)行方法的比較和初步應(yīng)用，以期為后期進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌ATCC6538作為參考菌株，其他菌株：豬鏈球菌II型、大腸桿菌ATCC25922、蠟樣芽孢桿菌ATCC11778、單核細(xì)胞性李斯特菌ATCC19115、副溶血弧菌ATCC17802、阪崎腸桿菌ATCC29544、志賀菌ATCC12022、沙門氏菌H9812均由本實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker（BP）瓊脂基礎(chǔ)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（trypticase soy broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）、1%亞碲酸鉀卵黃增菌液 海博生物技術(shù)有限公司；DL2000 Marker、TaqPCR Mix預(yù)混液（2X含藍(lán)染料） 北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；氯化鈉 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；G-10電泳瓊脂糖凝膠 西班牙Biowest公司；Tris-HCl、EDTA 北京博奧拓科技有限責(zé)任公司；Premix ExTaq（Probe qPCR）、TB Green Premix ExTaqII、核酸染料GELVIEW 寶生物工程（大連）有限公司。

CFX96熒光定量PCR儀、VerSaDoc2000凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad有限公司；TSNENEN031445 PCR儀基因（美國）有限公司；POCKITTM小型智能型核酸分析儀、R-tube（48） 廈門金瑞鴻捷生物科技有限公司；SC-15數(shù)控超級恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；5804R型冷凍離心機 Eppendorf生命科技公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；WD800B型微波爐 順德市格蘭仕微波爐電器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 引物及探針的設(shè)計與合成

選取金黃色葡萄球菌的nuc基因作為目標(biāo)基因，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計一對引物及探針，并對引物與探針進(jìn)行BLAST比對。另一對常規(guī)PCR引物參考唐俊妮等[21]的引物，詳細(xì)引物信息見表1。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物、探針基本信息Table 1 Sequences of primers and probes used in this study

1.3.2 模板DNA的提取

參考酚-氯仿提取法[22]、水浴提取法[23]、微波提取法[24]提取模板DNA，并對3種方法的擴(kuò)增效果進(jìn)行對比。

1.3.3 iiPCR反應(yīng)體系的探索

參考李凡等[15]建立的牛冠狀病毒iiPCR方法。采用25 μL體系分別對已知濃度的Taq酶（預(yù)混酶）5 U/μL（11～13.5 μL）上下游引物10 μmol/μL（0.5～2 μL）、探針10 μmol/μL（0.25～1 μL）、模板DNA（1～4 μL）、無菌水的用量進(jìn)行條件探索，確定各自用量的最佳值。

1.3.4 特異性實驗

采用上述擴(kuò)增體系，結(jié)合POCKITTM手持式核酸分析儀對提取的金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、豬鏈球菌、阪崎腸桿菌、志賀菌的模板DNA進(jìn)行檢測，以判定該方法的特異性。

1.3.5 靈敏性實驗

將純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液通過10 倍稀釋成不同的濃度梯度（100～10-10），提取各個濃度模板DNA采用上述體系并結(jié)合POCKITTM手持式核酸分析儀進(jìn)行檢測，確定其檢出限。

1.3.6 穩(wěn)定性實驗

參考謝國駟等[25]的方法，采用上述擴(kuò)增體系并結(jié)合POCKITTM手持式核酸分析儀分別對純培養(yǎng)菌液的3個稀釋度（10-6、10-7、10-8）提取的模板DNA進(jìn)行3 次重復(fù)性實驗，以評價該方法的穩(wěn)定性。

1.3.7 人工模擬污染食物樣品的檢測

將起始接種總數(shù)量為100 個CFU的金黃色葡萄球菌分別接種到250 mL的脫脂牛奶和10 g豬肉中進(jìn)行培養(yǎng)，之后在細(xì)菌生長過程中的第2、4、6、8小時進(jìn)行取樣，同時采用傳統(tǒng)PCR方法和iiPCR方法進(jìn)行檢測，對比其檢測結(jié)果。傳統(tǒng)PCR體系及反應(yīng)條件：TaqPCR Mix預(yù)混液（2X，含藍(lán)染料）10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、模板DNA 1 μL、無菌超純水補足至20 μL體系；反應(yīng)擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物于4 ℃保存或進(jìn)行凝膠電泳檢測。產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測：配制瓊脂糖凝膠為1 g/100 mL，取4.5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行點樣，90 V、72 A條件下電泳40 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.3.8 采集實際食物樣品

市場上采集20 份食品樣品，每份10 g直接分裝至7.5%氯化鈉肉湯中富集培養(yǎng)，采用傳統(tǒng)PCR方法、iiPCR方法對樣品進(jìn)行檢測，同時根據(jù)GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》對檢測結(jié)果進(jìn)行驗證[26]。

表2 樣品采集信息Table 2 Information about samples collected in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 模板DNA提取方法的比較結(jié)果

采用酚-氯仿提取法、水浴提取法、微波提取法提取DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。3種方法都能擴(kuò)增出目的條帶，但考慮到酚-氯仿提取法所使用試劑有毒，所耗時間長；微波提取法對微波爐功率有一定要求；而水浴法操作簡便，因此，本研究選擇水浴法作為細(xì)菌DNA提取的方法。

圖1 模板DNA提取方法擴(kuò)增產(chǎn)物的比較Fig. 1 Comparison of PCR-amplified products of template DNA extracted by different methods

2.2 iiPCR體系的探索結(jié)果

經(jīng)過篩選確定，摸索出iiPCR最終反應(yīng)體系：5 U/μLTaq酶（預(yù)混酶）12.5 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，10 μmol/μL探針0.5 μL，模板2 μL，補足無菌水至25 μL。

2.3 iiPCR的特異性實驗結(jié)果

將金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、豬鏈球菌、阪崎腸桿菌、志賀菌的DNA按上述擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖2，圖中POCKITTM手持式核酸分析儀界面上顯示只有金黃色葡萄球菌檢出為陽性結(jié)果（+），陰性對照和單核細(xì)胞性李斯特菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、豬鏈球菌、阪崎腸桿菌、志賀菌均檢出為陰性（-）。表示針對金黃色葡萄球菌所建立的iiPCR檢測方法特異性良好。

圖2 iiPCR特異性實驗Fig. 2 Specificity evaluation of iiPCR

2.4 iiPCR的敏感性實驗結(jié)果

將純培養(yǎng)濃度為109CFU/mL金黃色葡萄球菌菌液，通過梯度稀釋培養(yǎng)液，然后采用上述擴(kuò)增體系對不同稀釋濃度的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3，可以看出，POCKITTM手持式核酸分析儀界面上陰性對照和濃度為10 CFU/mL時顯示為陰性（-），濃度為103CFU/mL和102CFU/mL顯示為陽性（+），說明建立的iiPCR檢測方法對金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)液的檢出限為102CFU/mL。

圖3 iiPCR敏感性實驗Fig. 3 Sensitivity evaluation of iiPCR

2.5 iiPCR的穩(wěn)定性實驗結(jié)果

采用本研究建立的iiPCR方法對3個稀釋度（10-6、10-7、10-8CFU/mL）的模板DNA分別進(jìn)行3 次重復(fù)性檢測，從圖4可看出，POCKITTM手持式核酸分析儀界面上10-6CFU/mL和10-7CFU/mL顯示為陽性（+），10-8CFU/mL和陰性對照顯示為陰性（-），3 次重復(fù)檢測結(jié)果一致，表示所建立的iiPCR方法穩(wěn)定性良好。

圖4 iiPCR穩(wěn)定性實驗Fig. 4 Stability evaluation of iiPCR

2.6 人工模擬污染食物樣品的檢測結(jié)果

2.6.1 豬肉樣品的檢測結(jié)果

對豬肉中培養(yǎng)至第2、4、6、8小時的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖5。在培養(yǎng)至第2、4小時，傳統(tǒng)PCR方法和iiPCR方法均不能檢測出樣品；培養(yǎng)至第6小時，豬肉樣品中的金黃色葡萄球菌數(shù)量約為1 000 CFU/mL，建立的iiPCR方法可以得到檢測結(jié)果為陽性，傳統(tǒng)PCR方法檢測結(jié)果為陰性。在培養(yǎng)至第8小時，傳統(tǒng)PCR方法和iiPCR方法均能得到陽性檢測結(jié)果，此時金黃色葡萄球菌數(shù)量約為105CFU/mL。

圖5 豬肉樣品檢測結(jié)果Fig. 5 Results of iiPCR and traditional PCR for pork samples

2.6.2 脫脂牛奶樣品的檢測結(jié)果

對脫脂牛奶中培養(yǎng)至第2、4、6、8小時樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖6。培養(yǎng)至第2、4小時，傳統(tǒng)PCR方法和iiPCR方法均不能檢測出陽性結(jié)果；培養(yǎng)至第6小時，脫脂牛奶樣品中的金黃色葡萄球菌數(shù)量約為100 CFU/mL，建立的iiPCR方法可檢測出陽性結(jié)果，傳統(tǒng)PCR方法檢測結(jié)果為陰性。培養(yǎng)至第8小時，傳統(tǒng)PCR方法和iiPCR方法均能得到陽性檢測結(jié)果，此時金黃色葡萄球菌數(shù)量約為105CFU/mL。

圖6 脫脂牛奶樣品檢測結(jié)果Fig. 6 Results of iiPCR and traditional PCR for skim milk samples

2.7 實際采集食物樣品的檢測結(jié)果

2.7.1 實際樣品檢出結(jié)果

采用建立的iiPCR方法對采集的20 份實際樣品進(jìn)行檢測，在培養(yǎng)至第6小時iiPCR方法擴(kuò)增結(jié)果見圖7，可看出此時iiPCR方法可對17 份樣品檢出陽性結(jié)果，6號、8號和18號樣品未檢出，檢出率為85%（17/20）。

圖7 建立的iiPCR在培養(yǎng)至第6小時檢測食品樣品的結(jié)果Fig. 7 Results of iiPCR for food samples at 6 h

2.7.2 iiPCR方法與其他檢出方法的比較

采用建立的iiPCR方法、傳統(tǒng)PCR方法以及傳統(tǒng)培養(yǎng)法對采集樣品檢出結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。在培養(yǎng)至第8小時傳統(tǒng)PCR方法擴(kuò)增結(jié)果見圖8，可看出此時傳統(tǒng)PCR方法只能對14 份樣品檢出陽性結(jié)果，檢出率為70%，3、6、8、10、17、18號樣品未能檢出。進(jìn)一步對未檢出樣品進(jìn)行培養(yǎng)，直到培養(yǎng)至第12小時，傳統(tǒng)PCR方法才可對3、10、17號樣品檢出陽性，結(jié)果見圖9。同時根據(jù)GB 4789.10—2016對培養(yǎng)至第16小時的樣品進(jìn)行分離鑒定，部分結(jié)果見圖10，所有能檢出的陽性樣品在BP瓊脂上均能生長出金黃色葡萄球菌的典型菌落形態(tài)，菌落呈灰黑色、周圍有淺白色的邊緣并繞以不透明圈，其外有一清晰帶，通過鏡檢染色進(jìn)一步鑒定，并同時進(jìn)行PCR確認(rèn)，結(jié)果見圖11，除6、8、18號樣品檢測為陰性，其他17 份樣品檢測均為陽性結(jié)果，培養(yǎng)至第6小時iiPCR方法檢測出的結(jié)果一致。可見，由本研究建立的金黃色葡萄球菌iiPCR檢測方法耗時更短，且應(yīng)用于實際食品樣品檢測時，快捷、實用和準(zhǔn)確度高。

圖8 傳統(tǒng)PCR檢測食品樣品結(jié)果（8 h）Fig. 8 Results of traditional PCR for food samples at 8 h

圖9 食品樣品3、10、17號采用傳統(tǒng)PCR在培養(yǎng)至第6、8、10、12小時的檢出結(jié)果Fig. 9 Results of traditional PCR for food samples 3, 10, and 17 at 6, 8, 10 and 12 h

圖10 傳統(tǒng)培養(yǎng)法驗證Fig. 10 Results of validation by traditional culture method

圖11 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果Fig. 11 PCR identification results of bacteria isolated by traditional culture method

表3 3種檢測方法的比較結(jié)果Table 3 Comparison of results of three detection methods

3 討論與結(jié)論

本研究基于iiPCR技術(shù)，建立一種適用于快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，在縮短檢測時間的同時，提高了工作效率。至今發(fā)現(xiàn)的SEs和類腸毒素共有27 種[27-28]，有相關(guān)報道認(rèn)為金黃色葡萄球菌污染食品并產(chǎn)生危害是在生長對數(shù)后期或達(dá)到生長穩(wěn)定期時，此時SEs大量產(chǎn)生，造成食物中毒[29-31]。因此，在產(chǎn)生毒素前及時檢測出結(jié)果十分必要。本研究建立的iiPCR方法可以滿足這一要求。

本研究在模擬的食物基質(zhì)檢測表明，含量很低的金黃色葡萄球菌在前4 h生長速度相對較緩慢，而在4 h之后則開始生長加快，建立的方法可從培養(yǎng)6 h人工污染的脫脂牛奶和豬肉中提取出細(xì)菌模板DNA，并檢測到金黃色葡萄球菌的存在，而傳統(tǒng)的PCR檢測方法需要更久的培養(yǎng)時間，說明方法的敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)PCR方法；另外發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌在脫脂牛奶和豬肉中前8 h的生長速度低于在TSB中的生長速度，可能由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的種類和含量比脫脂牛奶和豬肉更適合細(xì)菌生長[32]。目前，對于食品中金黃色葡萄球菌的檢測一般都是按照國標(biāo)方法[26]，首先進(jìn)行細(xì)菌的富集培養(yǎng)，再進(jìn)行細(xì)菌的分離純化，耗時較長，通常需要2～3 d甚至更久才能完成整個檢測過程。本研究探討對食品樣品中金黃色葡萄球菌的iiPCR檢測，通過對樣品進(jìn)行簡單前處理，只需在7.5%氯化鈉肉湯中富集 6 h后，配合水浴法提取模板DNA，證實建立的iiPCR方法可檢測食品樣品中的金黃色葡萄球菌，說明模板DNA提取探索和方法的建立成功。Tsen等[20]針對雞肉中沙門氏菌檢測，建立了iiPCR方法，并經(jīng)實驗證明雞肉樣品只需富集5 h，就可利用iiPCR檢測沙門氏菌，本研究的結(jié)果也達(dá)到了同樣效果。結(jié)合POCKITTM系列手持式核酸檢測儀42 min的反應(yīng)和結(jié)果的顯示，省去繁瑣的凝膠電泳過程，大大節(jié)省時間。可見，采用的iiPCR技術(shù)在目標(biāo)細(xì)菌的富集時間上節(jié)省了至少2 h以上，再加上傳統(tǒng)PCR所需的擴(kuò)增反應(yīng)時間和凝膠電泳時間，整個檢測時間可縮短至少5 h以上。傳統(tǒng)PCR方法檢測整個流程所需至少12 h甚至更久，而iiPCR方法檢測整個流程可在7～8 h完成，操作更便捷。當(dāng)然，本研究中也存在一定的不足，未來將擴(kuò)充菌株的驗證數(shù)量，進(jìn)一步加大該方法的使用和評價。

綜上，本研究建立的一種基于iiPCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的方法，對方法進(jìn)行初步應(yīng)用，證明該方法具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好的特點。將該方法結(jié)合水浴法快速提取模板DNA以及POCKITTM手持式核酸分析儀，通過設(shè)計特異性引物和探針，可實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的現(xiàn)場快速檢測。從目標(biāo)細(xì)菌富集，到模板DNA提取，特異性基因擴(kuò)增到出現(xiàn)檢測結(jié)果，整個過程可在7～8 h完成。相比于傳統(tǒng)PCR檢測方法，至少節(jié)省了5～6 h的檢測時間，省去凝膠電泳過程，操作更便捷。