肌少-骨質疏松癥動物模型及評價方法研究進展

鄭浩 姚嘯生 路翀 杜一峰 葉嘉杰 于紅衛

1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847 2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032

肌少-骨質疏松癥(osteo-sarcopenia，OS)是肌少癥(sarcopenia，SP)與骨質疏松癥(osteoporosis，OP)協同致病的結果[1]。隨著社會人口老齡化的程度日益加劇，OS的發病率也在逐年上漲[2]。一項研究征集了2 353名社區老年人，發現60～64歲的男性OS發病率為14.3%，而女性OS的發病率高達20.3%[3]。其中SP是以年齡相關的肌肉質量損失、肌肉力量降低和(或)機體活動性功能減退為主要特征的退行性疾病[4]；OP屬于全身性骨病范疇，以骨量降低、骨的微觀結構退化以及骨的脆性增加為主要特征[5]。當兩者協同致病時，一定程度上增加了老年人跌倒的風險，導致脆性骨折的發病率大幅上升[6]，嚴重影響了老年人的健康并給社會醫療帶來巨大負擔[7-8]。

為了深入研究OS的病理機制并研制有效的臨床藥物，構建切實有效的OS實驗動物模型至關重要。本文以鼠為主要模型動物，介紹衰老OS模型、去勢OS模型、化學誘導OS模型、廢用OS模型以及基因OS模型的研究進展，對不同造模方式的優缺點和適用范圍進行綜述，并簡述OS模型的評價指標。

1 動物模型

1.1 衰老OS模型

衰老是大多數肌骨疾病的主要危險因素，因此衰老模型被廣泛應用于OS的研究中[9]。大鼠的預期壽命約為24個月，對比大鼠與人腦衰老過程中銅通量的改變，推算出18～24月齡的大鼠相當于56～69歲的人類[10]。Kim等[11]研究發現18月齡C57BL/6J鼠的骨骼肌質量、骨骼肌力量以及運動能力均明顯低于10周齡的鼠，提示18月齡的C57BL/6J鼠可能存在SP。在Zhu等[12]的研究中，15月齡雌性SD大鼠的腰椎和雙側股骨骨密度(bone mineral density，BMD)以及骨礦含量明顯低于3月齡大鼠，提示15月齡的大鼠符合OP自然衰老模型。因此推測構建OS自然衰老模型可以選用18月齡鼠。除了月齡，大鼠的性別對衰老模型也有一定的影響，由于雄鼠比雌鼠壽命更長，且雌鼠會分泌大量雌激素，不利于模型的建構，因此大多數研究傾向于選擇雄鼠進行造模[13]。

由于自然衰老模型建模周期較長，為了縮短衰老OS的建模時間，研究人員給予大鼠高脂飲食，因為高脂飲食是一種公認的衰老加速器[14]。Hu等[15]研究發現，高脂飲食模型鼠肌細胞的再生能力和分化能力嚴重受損。不僅如此，高脂飲食帶來的肥胖還會增加炎癥細胞因子[16]以及降低脂聯素的表達水平[17]，從而導致BMD下降[16-17]，因此高脂飲食能加速構建衰老OS模型的。除外高脂飲食還可以選用衰老加速易感鼠(senescence accelerated mouse/ prone，SAMP)進行造模，Azuma等[18]研究發現SAMP6鼠骨小梁形成明顯減少，而骨髓中脂肪含量明顯增多，是理想的加速衰老OP模型。Guo等[19]深入研究還發現8月齡的SAMP8鼠處于SP早期，而10月齡的SAMP8鼠則已經處于SP階段。因此可以配合高脂飲食或選用SAMP鼠建構加速衰老的OS模型。

1.2 去勢OS模型

去勢作為目前較為公認的OP造模方式，其起源可追溯到1969年，Saville等[20]通過手術摘除大鼠雙側卵巢(OVX)，隨后發現大鼠表現出明顯的骨質疏松癥狀。深入研究發現雌性SD大鼠去勢后，體內雌二醇(E2)水平明顯下降，導致促卵泡素以及促黃體生成素的分泌量上升，從而影響骨代謝，破骨大于成骨，骨量下降最終發展為OP[21]。Wang等[22]以及Wen等[23]的研究也解釋了其中的原理，研究發現去勢大鼠體內miR125b水平上升，過表達的miR125b能通過miR-125b-TRAF6通路促進骨質疏松[22]。除此之外去勢還會影響腸道菌群，并通過“菌群-腸道-代謝-骨”影響骨代謝，導致OP[23]。

去勢導致的低E2狀態還在一定程度上降低鼠骨骼肌的質量和力量，Karvinen等[24]在OVX術后6周處死模型鼠，從腓腸肌中分離出RNA，分析發現E2的下降影響了凋亡相關的microRNAs，導致肌細胞凋亡增加，骨骼肌質量下降，最終模型鼠出現SP。Ezzat-Zadeh等[25]將10月齡的SD雌性大鼠去勢后繼續飼養5個月，隨后進行大鼠的運動能力、肌骨形態學以及血清檢測，發現模型鼠活動量顯著減少、骨量下降9.6%，骨骼肌質量與體重比下降10.5%，結合血清指標提示OVX術后6周的SD雌性鼠同時存在骨質疏松和骨骼肌萎縮，即成功構建了OS模型。

1.3 化學誘導OS模型

化學誘導法是通過將誘導肌骨退變的物質直接注射或灌入模型體內從而誘發OS。構建化學誘導模型最常用化學物質的是糖皮質激素(Glucocorticoid，GC)，研究發現長期應用GC會帶來肌肉萎縮[26]、皮質骨和小梁骨強度降低等副作用[27-28]。深入研究發現長期應用GC能通過影響腸道菌群[29]以及氧化應激反應[30]導致骨丟失。同時Massaccesi等[31]以及Nakashima等[32]研究發現長期使用地塞米松(DXM)會上調O-GlcNAcylation[31]以及atrogin-1/MAFbx[32]的表達水平，導致肌肉萎縮。

在Aru等[334]的研究中，雌性Wistar大鼠在連續注射DXM后，出現大鼠體重和瘦體重下降，同時后肢抓力下降了25%，認為成功構建了SP模型。Yang等[34]給8周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠以1 mg/kg的劑量注射DXM每周2次。12周后進行雙側股骨和第5腰椎BMD、micro-CT以及骨生物力學檢查，同時檢測骨轉化指標，發現DXM化學誘導后大鼠的BMD、骨微觀結構和骨生物力學指標均顯著下降，提示OP模型構建成功。而在Pal等[35]的研究中，大鼠連續4周每天皮下注射5 mg/kg的甲基強的松龍(MP)，通過micro-CT、骨強度以及肌骨形態學等檢測結果判定OS模型構建成功。

1.4 廢用OS模型

廢用模型有多種不同的構建方式，例如后肢懸吊/卸載(HLS/HLU)、脊髓損傷(SCI)、注射肉毒桿菌毒素(BTX)以及石膏繃帶固定等[36]。Mankhong等[37]的研究表明HLS能通過破壞誘導氧化失衡、線粒體功能障礙、炎癥反應以及蛋白平衡失衡等多種方式誘導肌肉萎縮，并且HLS已被證實可以模擬臨床SP患者[38]。研究發現，在廢用模型中骨骼受到的機械負荷明顯減少，導致骨量迅速喪失[39]。Peres-Ueno等[40]的研究結果證明了這一觀點，將26月齡的雌性Wistar大鼠實施HLU，3周后發現HLU大鼠股骨BMD明顯下降，骨微結構嚴重惡化。因此，HLS/HLU能成功構建OS模型。

Brent等[41]將4 IU的BTX注射到12～14周齡雌性Wistar大鼠右后肢骨骼肌中，6周后通過雙能X線吸收法(DXA)、μCT、力學測試以及肌骨形態學檢測，發現廢用模型的肌肉質量下降63%，骨體積分數(BV/TV)下降28%，骨小梁厚度(Tb.Th)減小11%，骨干皮質厚度降低10%，股骨遠端干骺端骨強度降低27%，提示BTX成功構建了OS模型。在Yarrow等[42]的研究中，使用14周齡的雄性大鼠制造SCI模型，在損傷后21 d，發現SCI大鼠的骨小梁數量減少70%，Tb.Th減少13%～27%，小梁分離增加，除此之外還發現SCI大鼠小腿三頭肌肌量減少35%，提示SCI能成功構建OS模型。

1.5 基因OS模型

基因模型的造模方式主要有轉基因造模法和基因突變造模法，其中轉基因造模法多是指采用基因敲除的方式來構建動物模型。研究表明慢性炎癥是導致SP重要病機之一，Ko等[43]研究現IL-10缺失模型鼠骨骼肌中的三磷酸腺苷合成率下降，線粒體功能明顯受損，除此之外，IL-10基因的純合子缺失在一定程度上會促進NF-κB炎癥介質的表達。因此該模型可以模擬人身體炎癥、肌肉無力以及整體活動降低的狀態[43]。另一種常用的基因敲除模型是銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)敲除鼠，Sataranatarajan等[44]研究發現SOD1缺失的模型鼠在5月齡時就表現出多種SP的典型表型。而在使用基因敲出制造OP模型時多選擇敲除雌激素受體α/β或芳香酶，研究表明這種模型具有全身骨質疏松且不受外界因素干預等特性[45]。除此之外，研究表明目前至少有100多種目的基因與OP存在密切聯系，例如OPG、RANKL、RUNX2以及VEGF等[46]。

2 不同造模方式的特點及應用范圍

5種造模方式均可以成功構建OS動物模型，不同的建模方法均有著各自的優缺點和適用范圍，應當根據實驗的目的、方向、設備以及時間等因素選用最佳的造模方式[47]。

(1)自然衰老模型能最大程度地反映衰老的過程，該模型適用于正常衰老相關OS的研究，但該模型需要花費大量時間構建，花費大量人力及時間成本。為了解決自然衰老模型建模時間長的問題，研究人員使用高脂飲食加速模型衰老，但是該模型伴隨體脂增高，是老年肥胖OS的理想模型，但不適用于瘦體質老年OS。另一種加速衰老的SAMP模型無法體現衰老引起的OS，但因其建模周期短，可用于研究各種干預措施對OS的影響。(2)去勢模型的特征是能模擬雌激素缺失引起的肌骨退變，因此是女性絕經后OS的理想模型，無法模擬老年男性OS，除此之外，去勢手術需要操作人員具備一定的外科手術技術，且麻醉及手術過程對動物都是不可忽視的損傷。(3)臨床上存在一部分人群需要長期大量應用激素等化學物質，其患OS的概率高于正常人，研究這類人群的OS需要應用化學誘導模型。化學誘導模型的缺點在于化學藥物的種類多，且用法用量缺乏統一的標準。(4)在廢用模型中，HLS構建的模型是一種與運動無關的OS模型，能模擬術后長期臥床引起OS，但是HLS操作較為復雜，并且需要定期檢驗制動是否失效；使用BTX構建模型，造模時間短，但存在模型致死的風險；SCI建構的OS模型能很好地模擬脊髓損傷患者的OS，其缺點在于應用范圍有限。(5)基因模型能較快地建立OS模型，并且其靶向性明確，其缺點是沒有正常衰老的特征，除此之外，基因模型一次只能有一兩個基因被敲除，難以探究基因之間的相互作用。

除此之外，還有研究人員將兩種造模方式結合使用，例如去勢結合糖皮質激素構建OS模型[48]，這種模型肌肉萎縮以及骨質疏松的程度更高，雖然對應臨床上這樣的患者數量較少，但是可以應用于嚴重OS的研究。

3 OS模型的評價方法

3.1 骨骼肌相關評價方法

骨骼肌相關指標主要圍繞著骨骼肌的力量、骨骼肌的質量以及骨骼肌的功能3個方面展開。其中骨骼肌力量可應用抓力測定儀通過測量鼠前肢或四肢抓力判斷[49]；骨骼肌質量則可以通過CT、MRI、DXA或生物電阻抗分析，其中CT和MRI可以最直接、最準確地測量肌肉質量[50]；骨骼肌功能則可以通過旋轉器試驗[51]或水迷宮實驗[52]反應。除此之外，骨骼肌的微觀形態也是重要觀測指標。

3.2 骨相關評價方法

骨相關評價指標主要有BMD、骨生物力學、骨形態和骨轉化指標。其中BMD是診斷OP的關鍵指標，測量BMD的最常用方法是DXA[53]，而micro-CT也是常用的BMD測量方法，并且micro-CT還能觀察骨的微觀結構形態[54]；骨生物力學可以判斷骨的強度、硬度和韌性，多通過三點彎曲實驗、旋轉實驗以及疲勞實驗等方法測量；骨轉化指標則是通過測量血鈣、血磷、成骨指標以及破骨標志來判斷骨代謝水平。

4 小結

OS病理機制的核心是骨骼肌與骨的退變，現代研究發現骨骼肌與骨組織在生物力學以及內分泌等多個方面存在密切聯系，例如骨骼肌分泌的肌抑素、鳶尾素等肌動因子，不僅能調節骨骼肌生長，還在一定程度上影響骨代謝[55]。而中醫學“骨肉不相親”理論中也有“故骨髓不濡，即肉不著骨，骨肉不相親，即肉濡而卻，肉濡而卻……骨先死”的論述，深刻地闡釋了肌骨退變之間的聯系。提示骨骼肌與骨的退變多協同發生，這是文中5種造模方式能成功構建OS模型的理論基礎。但OS屬于進展性的長病程疾病，現階段的動物模型多側重于表現OS的某種病因或某一階段的病理改變，不能完全體現人類患OS的病理變化過程。并且不同的造模方式都有著各自的優缺點，在設計實驗時，需對應OS的不同病因以及病理階段，選擇最適合的造模方式。今后的研究將著眼于如何攻克各造模方式的缺點，使OS模型的設計更佳符合相似性、可靠性、重復性、適用性、可控性、易行性和經濟性的造模原則，為深入探究OS并研制有效臨床藥物做出貢獻。