Th17/Treg細胞失衡參與類風濕關節炎發病機制的研究進展

王濤王鋼汪湛東姜剛剛漆文霞

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜炎和血管炎為特征的最終引起關節軟骨及骨破壞的自身免疫性疾病。RA的發生與免疫功能紊亂、免疫細胞過渡活化以及免疫細胞亞群比例失衡密切相關[1]，其中CD4+T細胞直接與該疾病有關[2]。最近研究發現Th17/Treg的不平衡可能在RA的發展過程中起作用，Th17細胞主要通過分泌IL-17，加速自身免疫性疾病的發生。IL-17能夠誘導促炎因子(如TNF-α、IL-6和IL-1β)、趨化因子[如單核細胞趨化蛋白(MCP)-1和MCP-2]和MMP的產生，導致組織的炎性改變，以及關節軟骨和骨的損傷[3]。Treg細胞分泌的IL-10和TGF-β介導抗炎反應，維持自身免疫耐受狀態[4]，在RA的發展過程中，Treg細胞比例降低，功能受到抑制，而Th17細胞比例增加。TNF-α誘導的Treg細胞功能障礙與RA滑膜內IL-17和IFN-γ數量增加相關。TNF-α可抑制Treg細胞增殖及功能性細胞因子IL-10和TGF-β的分泌[5]，用TNF-α特異性抗體治療可恢復RA患者的Treg細胞功能。Th17/Treg失衡可能是RA發生發展的原因。因此調節Th17/Treg之間的平衡成為治療RA的一個靶點。本文將對Th17/Treg失衡在RA發病機制中的調節作用進行綜述。

1 Th17生物學特性

Th17細胞于2005年被首次提出，是由原始T淋巴細胞在IL-6和TGF-β的刺激下誘導分化形成的，Th17細胞的分化分為3個階段：①分化階段由IL-6和TGF-β啟動；②擴增階段由IL-21介導；③維持階段由IL-23維持Th17穩定與成熟[6]。在體內幼稚Th細胞在低濃度的TGF-β和IL-6共同作用下，激活JAK1進而磷酸化STAT3，上調轉錄因子維甲酸相關孤兒受體γt(RORγt)和視黃酸相關孤兒受體α(RORα)的表達，促進Th17細胞的分化。IL-21由Th17細胞分泌產生，IL-21可以促進Th17細胞表面IL-23R的表達，IL-23與IL-23R結合后依賴STAT3信號上調RORα和RORγt的表達促進Th17細胞的增殖，以自反饋方式調節Th17細胞的增殖[7]。IL-23并不影響Th17細胞分化，但可以促進Th17細胞的穩定與擴增，IL-23缺乏時無法檢測Th17細胞的存在。敲除IL-23亞基p19會下調Th17細胞數量，提示IL-23對于體內Th17細胞的增殖和存活有重要作用[8]。

Th17細胞主要通過對細胞因子的影響來發揮其生物活性的。Th17細胞可以產生IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、TNF-α等細胞因子。這些細胞因子能夠刺激不同的細胞，例如成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞和上皮細胞產生CXCL1、CXCL2、CXCL5、CCL2和CCL5這些趨化因子，也可產生NOS-2、MMP-3、GM-CSF以及致炎性細胞因子如IL-6、IL-1和TNF-α發揮其生物學作用[9]。此外，PGE2在IL-23存在下刺激了Th17細胞擴增，Th17細胞擴增又可以增加IL-23及IL-17的表達，進一步加重炎癥反應[10]。

2 Treg細胞生物學特性

Treg細胞是CD4+T細胞亞群之一，具有免疫抑制功能，它分為在胸腺的Treg(natural Treg，nTreg)和外周型Treg(induced Treg，iTreg)。nTreg直接從胸腺發育而來，iTreg在外周由幼稚的CD4+T細胞分化而來[11]。Treg細胞的標志性轉錄因子是叉頭盒蛋白P3(FoxP3)，Foxp3對于維持Treg細胞的分化成熟和功能發揮重要的作用，Foxp3基因敲除可導致nTreg細胞生成障礙，可導致免疫細胞增生性自身免疫病或消耗綜合征[12]。Foxp3表達增強，可導致部分CD4+T細胞轉化為Treg細胞，進而發揮抑制功能。在外周TGF-β可通過Smad2/Samd3磷酸化誘導Foxp3的表達，從而促進iTreg增殖[13]。

Treg細胞一方面分泌IL-10、TGF-β、IL-35等抗炎因子，IL-10、TGF-β二者共同誘導Treg細胞不斷成熟分化，使效應性T細胞的活化、增殖受到抑制，從而維持了機體的免疫平衡[14]，Treg細胞還可降低IL-17和IFN-γ的水平，抑制炎癥進展[15]。另一方面，Treg細胞能夠上調IL-2R的表達，通過IL-2R與IL-2競爭性結合，對其他T細胞的增殖發揮阻斷作用[16]。研究發現，成熟的Treg細胞需要持續的IL-2信號傳導來維持生存和抑制功能[17]。總之，Treg細胞在免疫自穩和免疫耐受的維持中發揮重要的作用，對預防自身免疫性疾病的發生具有重要的意義。

3 Th17/Treg細胞平衡

Th17和Treg細胞具有同源性，皆由初始CD4+T細胞分化而來。Th17細胞分泌促炎因子引起炎癥反應激發自身免疫，Treg細胞具有免疫抑制功能，兩者相互制約共同維護著機體內環境的穩定。不同的細胞因子對Th17/Treg細胞平衡有影響，其中TGF-β具有調節CD4+T細胞分化和發育、免疫耐受及內環境穩定的作用[18]。TGF-β既可誘導RORγt又可誘導Foxp3，是Th17和Treg細胞共同產生的關鍵細胞因子[19]，在組織微環境中低水平TGF-β與炎癥細胞因子IL-6、IL-1β、IL-21和IL-23共刺激時，初始CD4+T細胞向Th17細胞分化，而高水平TGF-β能抑制RORγt的活化及功能，進而上調Foxp3的表達導致Treg細胞分化[20]。Th17和Treg細胞分化過程中主要轉錄因子STAT3 和STAT5也參與調節Th17/Treg的平衡。IL-6在幼稚CD4+T細胞中通過STAT3通路活化增強Th17的分化，而且在TGF-β和IL-1存在下促進Tregs分化成Th17細胞。IL-2和IL-15誘導初始CD4+T細胞向Treg分化，是通過STAT5通路上調Foxp3表達而實現的[21]。低氧誘導因子1(HIF-1)也具有調節Treg/Th17平衡的作用，HIF-1可以下調Foxp3基因的表達，抑制初始CD4+T細胞向Treg細胞分化，還可以通過STAT3通路，使初始CD4+T細胞向Th17細胞方向分化[11]。某些自身免疫性疾病如RA、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥等的發生發展與Th17/Treg細胞失衡密切相關，探討Th17/Treg失衡與自身免疫性疾病的關系具有重要的意義。

4 Th17/Treg細胞的相關因子與RA

4.1 Th17細胞的相關因子與RA

Th17細胞分泌的細胞因子包括IL-17、IL-21、IL-22、TNF-α等細胞炎性因子，介導自身免疫性疾病的發生發展[22]。其中IL-17是Th17細胞特征性細胞因子，IL-17是導致慢性炎癥最主要的細胞因子，能夠引發皮膚、肌腱和滑膜的炎癥反應[23]，在RA關節炎癥和骨破壞中發揮重要作用。RA患者的關節液、滑膜組織、外周血以及外周淋巴結等處廣泛存在IL-17[24]，Bunte等[25]通過檢測28例早期RA患者血清中IL-13和IL-17水平，結果發現與對照組相比，早期RA患者血清中IL-13、IL-17濃度均顯著升高。IL-17協同TNF-α促進成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)和上皮細胞產生VEGF，促進血管翳生成，并大量分泌IL-6、IL-8、PGE2和GM-CSF等炎癥因子，IL-17還可刺激巨噬細胞產生IL-1β和 TNF-α，導致炎癥反應的發生。研究證明IL-17A/F通過上調RUNX2蛋白表達并增強IL-6和MMP3 mRNA的水平來降低RA軟骨形成潛能[26]。IL-17A通過誘導FLS中MMP-13的表達，抑制共培養體系中軟骨細胞COL2A1 mRNA和蛋白的表達，從而促進膠原降解，參與RA相關軟骨損傷[27]。IL-17通過IL-17/IL-17RA/STAT-3信號通路上調RANKL的表達，進而刺激滑膜部位的破骨細胞的生成與分化[28]。IL-17A還可激活MAPK家族 p38、ERK、JNK 等信號通路，促進滑膜炎癥反應，介導骨與軟骨破壞[29]。抑制RA患者的IL-17水平對于控制RA的炎癥及骨破壞具有重要的意義。Th17細胞分泌的另一個重要促炎性細胞因子是IL-21，IL-21在各種免疫細胞的激活和增殖中起著中心作用包括Th17細胞、Tfh細胞、B細胞、FLS細胞和巨噬細胞，這些細胞都參與RA發病[30]。RA患者外周血IL-21+CD4+T細胞頻率與疾病活動評分DAS28、血清抗環瓜氨酸肽(anti-CCP)抗體和類風濕因子(rheumatoid factor，RF)呈正相關[31]。IL-21能夠刺激中性粒細胞可增強STAT3磷酸化水平，促進IL-17A和IL-17F的產生，能上調RORC而促進Th17細胞分化與增殖。研究證明RA患者滑膜液中存在的Th17細胞產生大量的IL-21和IL-17，為IL-21的共刺激性提供了證據[32]。IL-21可激活ERK1/2、PI3K/AKT和STAT3通路，阻斷這些通路可抑制IL-21誘導的TNF-α和IL-6的增殖和分泌。這些結果提示IL-21可以促進RA-FLS的增殖和促炎細胞因子的產生[33]，IL-21還可以通過在CD4+T細胞和FLS中誘導RANKL表達，可促進RA中的破骨細胞生成，同時IL-21可以促進RA-FLS中的遷移、侵襲和MMP(MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13)的產生，其中MMP3、MMP9的活化與PI3K、STAT-3及ERK1/2有關[34]，這些通路激活后進而介導骨破壞。

4.2 Treg細胞的相關因子與RA

Tregs分泌抑制性細胞因子，包括IL-10、TGF-β等，杜文靜等[35]檢測CIA小鼠血清和滑膜組織中IL-10和TGF-β，結果發現小鼠血清和滑膜組織中IL-10和TGF-β表達水平均顯著升高。TGF-β通過減少RA患者炎性反應抑制免疫應答，減輕局部滑膜炎癥、抑制軟骨及骨組織的破壞[36]，Zhu等[37]在體內從RA或骨關節炎患者的滑膜中分離出成纖維細胞樣滑膜細胞，并培養4～8代。免疫熒光和Western blotting檢測(上皮間充質轉化)EMT標記物。TGF-β1或Smad2/3 siRNA處理RA-FLSs后，檢測EMT標志物，Transwell法檢測RA-FLSs的遷移和侵襲能力，論證了TGF-β1通過激活RA纖維母細胞樣滑膜細胞(RA-FLSs)中的Smad2/3誘導EMT，增強了RA-FLSs的遷移和侵襲能力。Xu等[38]研究發現在RA關節軟骨變性開始時，軟骨下骨中TGF-β的異常激活通過向RA影響的軟骨下骨髓中招募間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和骨祖細胞，破壞了正常的骨重塑過程。Li等[39]發現TGF-β 1通過誘導Tregs的產生來抑制軟骨的吸。IL-10可以調節Tregs的細胞凋亡并控制RA患者的自身免疫反應。IL-10對介導的免疫耐受至關重要，通過抑制抗原呈遞和促炎細胞因子分泌而發揮作用，是一種具有抗炎及免疫抑制功能的細胞因子。Luo等[40]發現從PBMC中分離出的Tregs可以通過IL-10和TGF-β 1防止破骨細胞分化和骨再吸收。IL-10通過降低RORγt的表達，抑制Th17 細胞，減少IL-17的分泌，并促進Treg細胞產生。研究發現[41]IL-10能夠減輕RA患者關節的腫脹和骨質的異常增生，其機制主要是IL-10通過激活STAT3信號通路進而調控2型巨噬細胞的分化。IL-10和IL-4還可同時抑制NF-κB 信號通路的活性，抑制局部的炎癥反應[42]。

5 Th17/Treg細胞失衡與RA

RA是一種慢性自身免疫性疾病，T淋巴細胞浸潤是其發病的關鍵。在整個疾病過程中Th17/Treg細胞呈現平衡失調狀態。吳曉亮[43]通過對40例RA患者Th17和Treg細胞的分化平衡進行研究，發現Th17/Treg水平與RA發生、發展具有一定相關性，RA患者Th17/Treg 水平顯著高于對照組，并且研究組中活動期患者Th17/Treg水平顯著高于穩定期。Niu等[44]研究表明RA患者外周血以CD4+T細胞增加為特征。Th17細胞比例增加和Treg細胞比例降低導致Th17細胞與Treg細胞之間的失衡在RA進展中起關鍵作用。研究發現[45]IL-21可抑制Foxp3的表達，引起Treg細胞功能障礙，在自身免疫反應條件下，它可以建立正反饋來放大Th17細胞打破Th17/Treg平衡，導致RA病情加重。Dong等[46]發現RA患者的miR-21水平顯著降低，miR-21參與調控Th17和Treg細胞分化的調控因子STAT3和STAT5，使STAT3表達的增加，STAT5及Foxp3 mRNA表達的下降，導致Th17/Treg平衡失調。在治療RA過程中，調節Th17/Treg的平衡是控制病情的作用靶點。Duarte等[47]研究發現，增加RA小鼠模型中滑膜Treg細胞，減少Th17細胞，糾正Th17/Treg 的比例，可在一定程度上延緩RA的病程。Wang等[48]發現酪氨酸羥化酶(TH)在CD4+T細胞中的表達有助于緩解RA大鼠模型中Th17/Treg失衡，CIA小鼠CD4+T細胞中TH基因過表達降低了Th17細胞百分率增加了Treg細胞相關細胞因子的表達和分泌，而TH基因敲除增強了Th17細胞相關細胞因子的表達和分泌，降低了Treg細胞的百分率。Duarte等[47]研究發現，RA小鼠模型中Th17/Treg的比例失衡，通過增加滑膜 Foxp3表達，減少Th17細胞的表達，糾正Th17/Treg的失衡，在一定程度上延緩RA的進展。Nie等[49]研究發現TNF-α可通過誘導Foxp3去磷酸化導致Treg細胞功能障礙，這與RA滑膜炎癥中產生IL-17和IFN-γ的CD4+T細胞數量增加相關。TNF-α特異性抗體治療后可恢復RA患者的Treg細胞功能，使Th17/Treg平衡，進而有利于控制RA。

綜上所述，眾多研究已經證實Th17/Treg失衡與RA的發生、發展關系密切，Th17/Treg失衡最終導致滑膜炎癥及軟骨及骨的破壞，加重RA的病情。Th17細胞促進炎癥反應，而Treg 細胞維持自身免疫耐受，抑制炎癥反應。二者之間的動態平衡對于控制RA的病情具有重要的意義，減少Th17細胞和增加Treg細胞是目前治療RA的一個方向，但在治療過程中如何把握Th17/Treg細胞的平衡點，以及Th17細胞與Treg細胞之間的相互聯系仍不清楚。因此，對Th17/Treg平衡及失衡在RA作用中進行深入研究，有利于揭示RA的滑膜炎癥與骨破壞的機制，對于尋找防治RA新的作用靶點具有重要意義。