骨碎補治療骨質疏松癥的實驗研究進展

高文鑫 陳云剛 姚康 郝延科

1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250000 2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP) 是以骨密度與骨量的下降, 骨組織微細結構退變為特征，導致骨質脆性的改變及人體全身骨代謝異常，因而常引起胸腰椎壓縮骨折、髖關節細微骨折等骨科病的一種退變性疾病[1-2]?！肮琴|疏松癥”這一病名在中醫古籍中未有詳細準確的記載，但由于其臨床癥狀大多表現為全身，尤其是腰背局部的廣泛性疼痛，且易發生細微骨折，與中醫“骨痿”的臨床癥狀較為相似，故常將其列為“骨痿”病的范疇[3]。骨碎補作為廣泛應用于治療骨痿的傳統中藥，味苦、性溫，具有補腎強骨、活血止血的作用?，F代藥理研究[4]表明，骨碎補能增強成骨細胞的活性，下調破骨細胞的活性，具有促成骨形成和減緩骨吸收的雙重作用。近年來，眾多學者對于骨碎補治療骨質疏松癥的作用機制和信號通路做了大量的實驗研究，但缺少系統的歸納與總結。本文將從骨碎補對間充質干細胞、成骨細胞和破骨細胞的作用及其對于骨質疏松癥治療的作用機制通路，對骨碎補治療骨質疏松癥的實驗研究進展進行綜述，旨在為下一步的臨床研究和實驗開展提供更為深入詳細的理論指導。

1 骨碎補對于間充質干細胞、成骨細胞和破骨細胞的作用

在生理條件下，成骨細胞、破骨細胞和骨細胞作為骨組織中的三種關鍵和重要的細胞類型形成了復雜的通信網絡，然而，過于活躍的成骨細胞介導的成骨活動或破骨細胞依賴性骨吸收導致骨質量或數量的病理學改變，從而出現骨質的硬化或骨質疏松癥[5]。骨碎補作為總黃酮類的一種混合物，其結構多樣、純化困難，而柚皮苷屬于黃酮類單體物質，稱多甲氧基黃酮，具備分子結構清晰、相對分子質量小、易于提純等特點。目前大部分實驗結果表明柚皮苷有促進骨的形成、抑制破骨的發生、抗氧化、抗炎、保護神經等作用，而在促進成骨、抑制破骨等方面的研究最為廣泛[6-8]。

1.1 骨碎補對間充質干細胞的作用

人類間充質干細胞是人體內的多能細胞，廣泛存在于成人骨髓中，可以未分化的細胞的身份進行復制與增殖，同時也具備分化為間充質組織的多向誘導分化能力[9]。間充質干細胞具有很強的免疫調節作用，并且能夠遷移到炎性組織和腫瘤細胞的位置，具有歸巢效應，被認為是精確性和選擇性地傳遞抗癌藥物的有效載體[10]。近年來，隨著在基因層面和免疫調節層面研究的更加深入，發現間充質干細胞可以產生具有向神經元提供治療性RNA功能的外泌體，也可以通過直接的細胞-細胞接觸或通過其分泌體與先天性免疫系統和適應性免疫系統的細胞進行強有力的相互作用[11]。

骨碎補中有效提取物柚皮苷可增強骨髓間充質干細胞的成骨作用[12]。王軍松等[13]研究發現，骨碎補總黃酮可能通過激活Wnt/β-catenin通路從而促進β-catenin、Runx2的表達，抑制PPARG的表達來達到促進BMSCs的倍增反應和成骨分化的作用。周涵[14]在研究人牙周膜干細胞時發現，柚皮苷可以通過激活具有調節多種發育過程的分泌性信號傳導通路Hedgehog信號通路，增強堿性磷酸酶活性和Runx2的表達，促進人牙周膜干細胞的成骨分化，但過高濃度(10 mg/L和100 mg/L)的柚皮苷長期作用后可能會抑制細胞的增殖分化，降低其在長時間內促成骨的作用。張虎林等[15]研究表明，不同劑量的骨碎補凍干粉(高劑量0.4 mg、中劑量0.1 mg、低劑量5 μg)可以誘導兔骨髓中的間充質干細胞向軟骨細胞分化，誘導后的細胞可通過細胞免疫組化可以檢測Ⅱ型膠原的表達，尤其以低劑量組效果最佳。以上研究表明，在不同的組織和細胞中，合適濃度的骨碎補可以通過不同的信號通路來增強間充質干細胞的成骨分化作用，但需要在合適的濃度內才能較好發揮作用，過高的藥物濃度反而會抑制細胞的增殖和分化能力。

1.2 骨碎補對成骨細胞的作用

成骨細胞是起源于多能間充質干細胞的骨形成細胞，Runx2和Osx被認為是成骨細胞譜系的主調節因子[16]。同時，成骨細胞是構建骨骼的細胞，在其分化的所有階段都需要嚴格調節，從而保證適當的骨骼發育和機體穩態[17]。成骨細胞衍生的血管內皮生長因子可以改善骨再生和治療骨愈合缺陷，并有研究[18]發現，隨著年齡的增長及骨量和骨血管的減少，血管內皮生長因子的水平明顯下調，可能會導致骨質疏松癥。

骨碎補提取物可通過調節多種代謝途徑和骨調節因子的表達來影響成骨細胞的增殖與分化。宋淵等[19]研究發現骨碎補含藥血清可明顯提高細胞增殖率、血清堿性磷酸酶(ALP)活性，有效促進鈣鹽沉積、骨鈣素分泌，提高鈣化結節形成數量，從而證明骨碎補可有效促進成骨細胞的增殖與成骨分化。Ge等[20]進行實驗證明柚皮苷通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，促進成骨細胞自噬，增強細胞增殖與分化，有效提高骨密度。Shen等[21]將實驗大鼠隨機分配成接受牽拉成骨技術治療組和常規骨折固定治療組，發現口服骨碎補總黃酮類化合物的大鼠通過調控PDGF-BB/PDGFR-β信號通路加快具有促進骨的成血管-成骨耦聯作用的CD31Emcn血管的形成，對成骨和血管形成具有積極的調節作用。Li等[22]發現骨碎補總黃酮化合物可以促進誘導膜中骨移植物的生長和礦化，促進成骨細胞的成熟與增殖。孟春力[23]的研究發現，骨碎補的乙醇提取物(濃度為0.02 g/mL)能對Runx2、OPN、OCN等成骨活性相關分子的表達有促進作用，增強成骨細胞的成骨活性，同時促進細胞周期的快速發展與增殖，這種調節過程可能與PI3K/AKT信號通路、ERK1/2信號通路的活化有關。通過上述體內和體外實驗我們發現，骨碎補可能通過激活不同的信號通路促進細胞自噬、成骨及血管形成的過程，達到促進細胞的成骨和增殖分化的目的。

1.3 骨碎補對破骨細胞的作用

破骨細胞是多核巨細胞，其活性缺陷導致骨髓衰竭，過量活動會導致骨質流失甚至骨質疏松癥，造成骨代謝紊亂[24]。破骨細胞在成人中是長壽的，并且它們的功能通過單個造血干細胞衍生的循環細胞與現有合胞體的迭代融合來維持[25]。數據表明，從親本細胞衍生的破骨細胞凋亡體的功能性遺傳顯示了它們在骨重塑中的破骨細胞-成骨細胞耦合中的橋接作用，對缺陷性修復區域血管生成和骨再生具有重要的影響[26]。

骨碎補提取液可抑制破骨樣細胞在骨髓體外培養時的分化增殖，通過抑制機制在破骨母細胞成熟轉化的過程中起作用，但與藥物濃度存在一定的聯系[27]。張峻瑋等[4]通過對去卵巢大鼠骨骼微細結構進行觀察，發現骨碎補灌胃后可明顯提高去卵巢大鼠的骨密度、骨小梁數量等骨的微細結構參數，調控破骨細胞的數量和活性水平明顯下降，同時抑制對于骨組織結構的吸收，具有明顯的骨保護作用。許金松等[28]通過對巨噬細胞向破骨細胞分化進行誘導的方法觀察不同濃度骨碎補含藥血清對巨噬細胞活性的影響，分析骨碎補總黃酮對破骨細胞分化成熟的作用。實驗表明，巨噬細胞被不同濃度含藥血清誘導分化后，各組與其余未經處理實驗組相比，在破骨細胞數、融合指數等評價細胞分化水平的指標上明顯減少，且降低程度與劑量呈正比關系，說明骨碎補含藥血清抑制大鼠巨噬細胞分化為破骨細胞的過程存在抑制。童徐[29]將小鼠顱頂骨的骨組織放入不同濃度的柚皮苷培養基中進行培養，對其進行TRAP染色，發現隨著實驗時間的延長，實驗組和對照組相比，著色的破骨細胞數量較前大幅度下降，且濃度為1 mg/L最為明顯。Wang等[30]研究發現，柚皮苷通過促進T細胞釋放IL-4來抑制RANKL誘導的破骨細胞生成和破骨細胞骨吸收。李風波等[31]研究結果表明，柚皮苷可通過降低破骨細胞表達基因 Bcl-2/BAX比值，加速破骨細胞的凋亡過程，從而減少成熟破骨細胞數目，降低破骨細胞的骨吸收能力，凋亡原理可能是通過抑制破骨細胞表達基因 Bcl-2，促進破骨細胞表達基因BAX，從而使BCL-2/降低，最終使 Caspase-3 活化，使破骨細胞進入無法逆轉的凋亡。王琛[32]通過建立大鼠實驗性牙周炎模型，對給予不同濃度柚皮苷標品的牙周組織病理切片進行觀察，發現實驗組中牙槽嵴頂的破骨細胞明顯減少，且4 %柚皮苷組有良好的抑制破骨能力。

綜上所述，骨碎補提取物對不同動物、不同組織的間充質干細胞的成骨分化，對成骨細胞的成骨活性、細胞分化與增殖等具有促進作用，同時可以有效抑制破骨細胞引起的骨吸收，從而達到維持骨代謝穩態、改善骨質疏松的作用。

2 骨碎補對于骨質疏松癥治療的作用機制通路

骨碎補可通過多條通路，從細胞的增殖、分化與機體的免疫反應、氧化應激反應等多個方面，對干細胞、成骨細胞、破骨細胞、免疫細胞等產生調節與平衡作用[33]，通過參與調控骨吸收與骨合成，調節機體內部骨代謝平衡，從而起到抗骨質疏松的作用。其中，有兩大類信號通路被學者們廣泛研究，一種是通過參與支配骨的形成、促進與骨形成相關信號蛋白的合成與釋放的信號通路，其中有較為典型的三種，分別是BMP-Smads信號通路、Wnt/β-catenin通路及 MAPK 信號通路；另一種是通過抑制骨吸收，降低骨質流失，進而避免骨質疏松癥發生的通路有OPG/RANKL/RANK 信號通路[34]。近年來，有一些實驗研究表明，骨碎補亦可通過雌激素通路及Notch通路來達到改善骨質疏松、調節骨代謝平衡的作用。

2.1 參與調控骨形成的信號通路

2.1.1骨碎補對于BMP-Smads信號通路的調控：骨形態發生蛋白(BMP)屬于轉化生長因子(TGF)-β超家族成員，具有促進胚胎發育、調控出生后骨骼生長及重建再生、誘導軟骨內骨形成、維持成體穩態平衡等作用[35]。Smads為BMP信號通路中的核心蛋白，對成骨細胞分化具有極為關鍵的影響[35]。BMP通過激活Smads蛋白進一步轉位至細胞核內充當轉錄增強因子及調控相關轉錄因子核心結合蛋白影響成骨相關基因的轉錄，從而促進骨的形成。因此BMP-Smads 信號通路可以調控成骨細胞基因的表達，在調節成骨細胞的成骨速率及進一步的成骨分化過程中發揮重要的作用[36]。

沈智等[37]研究發現骨碎補總黃酮(6.75 mg/mL)能有效提高懸尾實驗性骨質疏松大鼠細胞中BMP-2 mRNA的表達，從而起到抗骨質疏松作用。董航等[38]在研究載骨碎補總黃酮磷酸鈣骨水泥對骨缺損模型大鼠誘導膜中成骨細胞分化的影響時發現，骨碎補總黃酮可明顯促進大鼠骨缺損區新生骨細胞中BMP-2、Smad1、Smad4、Smad7等蛋白的表達，促進成骨細胞的成熟。Dong等[39]研究發現骨碎補及其標記化合物(柚皮苷)可以通過抑制BMP-2和BMP-1A的結合，阻斷BMP-1A信號的傳導，同時促進BMP-1B信號傳導，誘導骨細胞形成，從而控制細胞分化，導致成骨，并通過動物實驗證明骨碎補可能是骨組織工程的良好天然的BMP調節劑。通過以上研究結果可知，骨碎補可通過該通路的多個蛋白位點起作用，對具有骨誘導性的骨形態發生蛋白BMP-2作用尤為明顯，有效促進成骨細胞成熟分化，參與骨和軟骨的重建過程，進而加速骨缺損修復，有效改善骨質疏松癥。

2.1.2骨碎補對于Wnt/β-catenin信號通路的調控：Wnts是一類高度保守的分泌型糖蛋白，可以調節干細胞的多能性，在細胞增殖、分化及凋亡等分化發育過程中發揮著重要的調控作用[40]。Wnt/β-catenin 信號通路又稱為經典Wnt信號通路，Wnt/β-catenin信號通路通過β-catenin的核異位，激活靶基因的轉錄活性，干預間充質干細胞、成骨細胞以及破骨細胞等骨組織細胞的增殖及分化，廣泛參與骨代謝的調控[41]。

李琰等[42]對去卵巢骨質疏松大鼠進行骨碎補水煎液灌服處理后觀察大鼠骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化的調節作用時發現，經骨碎補水煎液灌服后大鼠BMSCs中Mnt10b、β-catenin、LRP5等基因表達顯著升高，LPL和PPARγ基因表達顯著下降，說明骨碎補可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進間充質干細胞的成骨分化，抑制其成脂分化。李晉玉等[43]在實驗中運用Wnt通路抑制劑DKK1，發現DKK1+骨碎補總黃酮組和DKK1+轉化生長因子β-catenin、LRP5、RUNX2、CyclinD1基因及蛋白表達明顯增加，且骨碎補總黃酮誘導的基因及蛋白表達水平與藥物劑量之間存在正比關系。陳云剛等[44]研究發現骨碎補含藥血清可明顯促進BMSCs的增殖，提高ALP的活性和礦化結節數，同時發現BMSCs經成骨誘導7 d后β-catenin、LRP5、RUNX2及Osterix mRNA的表達明顯上調，GSK-3β的表達顯著下調，胞質中β-catenin、LRP5的蛋白表達水平升高，表明骨碎補含藥血清可能通過激活Wnt/β-catenin 信號通路來實現BMSCs的成骨分化。以上實驗證明，骨碎補可通過激活Wnt/β-catenin 信號通路來誘導成骨細胞的增殖分化，從而有效治療骨質疏松癥。

2.1.3骨碎補對于MAPK信號通路的調控：MAPK信號通路是調控成骨細胞生長、增殖分化的重要途徑，在眾多MAPK 信號轉導通路中，ERK、p38 和 JNK 信號通路在細胞成骨分化中發揮著核心的作用[45]。EPK1和EPK2的許多底物參與控制細胞增殖、分化、存活和死亡的關鍵生理過程，維持細胞穩態[46]。p38是一種多任務激酶，通過與大量底物相互作用來調節細胞增殖、細胞分化、細胞應激反應、細胞凋亡以及細胞遷移和存活等，具有控制細胞周期進展的能力[47]。JNK信號通路具有調節細胞凋亡和存活的雙面性，可以誘導自噬來抑制癌細胞的凋亡[48]。

張力等[49]研究表明骨碎補總黃酮可加快成骨相關因子核結合因子α1 mRNA、堿性磷酸酶mRNA的轉錄，加入p38抑制劑SB203580后可使兩者表達明顯降低，說明骨碎補總黃酮可能通過MAPK/p38信號通路提高成肌細胞與成骨細胞之間的分化。齊鵬飛等[50]發現在模擬失重狀態下，骨碎補總黃酮可升高MAPK/ERK磷酸化水平，逆轉失重對細胞的影響，促進細胞中出現較高的堿性磷酸酶表達，進而促進間充質干細胞分化為成骨細胞，這可能與激活MAPK/ERK信號通路有關。以上研究表明，骨碎補總黃酮可能通過激活MAPK/p38和MAPK/ERK信號通路來促進成骨細胞的分化。

2.2 參與調控抑制骨破壞的信號通路

骨碎補對于OPG/RANKL/RANK信號通路的調控：OPG/RANKL/RANK系統以其在破骨細胞成熟、骨骼生長和骨重塑中的作用而聞名，NF-κB(RANK)的受體激活劑、NF-κB配體(RANKL)的受體激活劑和骨蛋白(OPG)是該信號系統的主要成分。OPG是特異性骨形成分泌蛋白，它與RANKL結合，發揮抗破骨細胞生成作用[51]。OPG作為RANKL的誘餌受體，參與抑制RANKL與RANK結合[51]。

張峻瑋等[52]對實驗大鼠使用骨碎補水煎液灌胃處理后提取骨髓間充質干細胞與破骨細胞共同培養，發現骨碎補水煎液灌胃處理后OPG蛋白表達上升，RANKL及RANKL/OPG蛋白表達下降，說明骨碎補通過調節OPG/RANKL/RANK信號通路來起到抑制破骨細胞分化成熟的作用。劉康等[53]發現不同濃度骨碎補總黃酮可使去卵巢骨質疏松大鼠血清雌二醇及OPG水平上調，RANKL及RANK水平明顯下降，從而達到減少破骨細胞的生成、抑制破骨細胞活化的目的。曾輝等[54]研究表明骨碎補總黃酮可使骨質疏松大鼠下頜骨骨髓腔縮小，骨小梁間隙減小，同時通過調節大鼠血清OPG水平及OPG/RANKL比值，從而達到抑制下頜骨破壞吸收、防治下頜骨骨質疏松的作用。以上研究表明，骨碎補總黃酮可能通過激活OPG/RANKL/RANK信號通路來抑制破骨細胞的分化成熟，從而起到防治骨質疏松癥的作用。

2.3 骨碎補對于雌激素水平的調控

Wu等[55]實驗證明柚皮苷增強了雌激素受體(ERα)向細胞核的易位及其反式激活活性，增加了具有骨缺陷的小鼠受損部位的ERα和ALP水平，同時提高了愈合率和骨強度。柚皮苷可以通過調節ERα依賴性ALP基因表達來改善成骨細胞礦化和骨愈合。Song等[56]的研究表明，柚皮苷可與雌激素受體結合，提高促進血管生成的關鍵因子VEGF的表達，從而促進基質中的增殖和粘附，通過調控骨質疏松大鼠的VEGF/VEGFR-2信號通路的方式來影響血管生成、促進骨折愈合。雌激素水平的快速下滑是影響絕經后婦女骨質疏松較為突出的因素之一，對于骨碎補與雌激素信號通路的關系尚在研究中，但以上研究為我們提供了思路，說明骨碎補總黃酮可能通過雌激素受體激動機制來調節骨代謝的平衡水平。

2.4 骨碎補對于Notch信號通路的調控

Notch受體家族包括4種類型的受體，分為Notch1、Notch2、Notch3和Notch4，在細胞分化和功能中起關鍵作用，其中Notch1和Notch2在機體整個發育過程中和成年哺乳動物中的許多組織中廣泛表達[57]。Notch信號傳導控制破骨細胞分化和骨吸收活性，要么直接作用于破骨細胞前體，要么間接作用于成骨細胞譜系的細胞和免疫系統的細胞[58]。

黃敏玲等[59]研究發現，骨碎補總黃酮可促進大鼠骨組織中血管內皮生長因子、CD31、Hes-1、BMP-2、Notch-1的表達，這可能與骨碎補總黃酮激活Notch通路從而促進成骨-成血管耦聯、促進骨組織的修復有關。黃翔宇等[60]發現JaggedⅠ(Notch配體)聯合去甲酸及骨碎補可下降Notch-1、Hes-1 mRNA和蛋白的表達，抑制Notch信號通路，改善骨質疏松。韓亞力等[61]骨碎補總黃酮可以提高血鈣和血磷水平，降低Notch-1、Hes-1 mRNA蛋白的表達，同時體外實驗發現骨碎補總黃酮可以下調去甲酸所致的大鼠骨髓基質細胞Notch-1、Hes-1 mRNA和蛋白水平的升高，從而調節骨代謝平衡，這可能與對于Notch信號通路的抑制有關。

近年來，針對藥物通過調控Notch信號通路來治療骨質疏松癥的實驗研究日益增多。國外有研究[62]指出一種可溶性的骨靶向融合蛋白D114激活Notch信號傳導，提高細胞成骨能力，促進小鼠的骨形成，且不會導致不良反應。國內在此方面的研究以單味中藥為主，尤以對于淫羊藿的研究為多。有研究表明，淫羊藿發揮抗骨質疏松療效主要是與其對Notch通路具有活化或抑制的雙重作用有關[63]。鑒于目前國內對于骨碎補通過調控Notch信號通路來治療骨質疏松癥的實驗研究較少，且實驗結論上存在較大差異，因此，結合與骨碎補同為補腎強骨類中藥淫羊藿的研究結果，能夠為進一步研究探討骨碎補對Notch信號通路是否具有雙向調節作用，明確其基本作用機制具有重要的思路借鑒和理論指導，同時，也為骨碎補治療骨質疏松癥的機制研究提供了新的思路和方向。

3 結語

如何有效防治骨質疏松、調節機體內部骨代謝平衡水平的臨床實驗研究一直是醫學研究的熱門話題，尤其是近年來對于傳統中藥如何有效防治骨質疏松、調節機體內部骨代謝平衡水平的臨床研究取得較為顯著的成果，其中骨碎補作為補腎強骨、活血化瘀類中藥的代表，對于其有效成分和作用機制研究更是成為熱點。大量實驗研究表明，在細胞分子水平，骨碎補可以通過調節間充質干細胞、成骨細胞和破骨細胞的分化水平來有效防治骨質疏松，但針對不同的細胞組織哪種濃度的骨碎補提取物效果最佳尚未得出明確的結論；在通路機制水平，骨碎補總黃酮可以通過作用于不同的通路機制來起到防治骨質疏松的作用，但具體通過哪種類型的通路起到最佳的治療效果尚未明確，尤其是對于激活還是抑制Notch信號通路來起作用尚需進一步研究，而且不同分子通路之間的相互作用需要進一步明確。另外，骨碎補總黃酮是由多種化合物混合而成，需要進一步純化有效成分，才能更有針對性治療骨科各類疾病。同時骨碎補總黃酮在以往的研究中多關注在防治骨質疏松癥方面，近年來又發現它在促進周圍神經再生作用、促進骨內血管再生、改善骨內血管微循環、抗炎止痛作用等方面的優勢，這一發現為骨碎補總黃酮在臨床治療中的應用開辟了更為全面的研究方向。