HPLC-DAD 法測定復方鮮竹瀝液中9 種防腐劑含量

劉艷梅，許妍，張靜，洪挺

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

復方鮮竹瀝液為甲類非處方藥，由鮮竹瀝、魚腥草等七味中藥組成，臨床用于痰熱咳嗽、痰黃黏稠的治療［1］。全國生產該制劑的生產企業共計十家，其中江西企業占據八家，屬于江西特色中藥制劑。復方鮮竹瀝液為液體制劑，液體制劑多以水為溶媒，易被微生物污染而發霉變質，尤其制法中加入矯味劑蔗糖或甜菊素，更易引起微生物的滋生與繁殖。復方鮮竹瀝液制法中加入0.3%的苯甲酸鈉作為防腐劑，但有關資料顯示pH 值對苯甲酸及其鈉鹽的抑菌效果影響很大，苯甲酸的最佳抑菌pH 值為2.0～4.0，一般以＜5.0 為宜，苯甲酸鈉的最適pH 值為≤4［2-5］，而復方鮮竹瀝液的pH 值為4.8～6.0［1］。為考察企業是否規范使用防腐劑，本實驗選擇了中藥液體制劑中常用的防腐劑苯甲酸、山梨酸、尼泊金酯類防腐劑（羥苯酯類）以及脫氫乙酸共計9 種進行考察，建立了HPLC-DAD 法同時測定復方鮮竹瀝液中9 種防腐劑含量,并對6 家企業共計94 批樣品和8 批次鮮竹瀝原料藥進行防腐劑的篩查和定量測定,以期為該制劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 lnfinity Ⅱ高效液相色譜儀，DAD檢測器，OpenLAB CDS 化學工作站（美國安捷倫公司）；Secura125-1CN 電子天平（德國賽托利斯公司）。

1.2 試藥

苯甲酸（批號：100419-201302，含量：100%），山梨酸（批號：190126-201501，含量：99.6%），羥苯甲酯（批號：100278-201404，含量：100%），羥苯乙酯（批號：100847-201203，含量：100%），羥苯丙酯（批號：100444-201403，含量：99.6%），羥苯丁酯（批號：110792-200503，含量：100%）購自中國食品藥品檢定研究院。脫氫乙酸（批號：BCBF0386V，含量：98.0%）購自ALDRICH。羥苯異丙酯（批號25192，含量：99.4%），羥苯異丁酯（批號41110，含量：99.7%）購自AccuStandard。復方鮮竹瀝液共94 批，來源于國家藥品抽檢計劃抽樣；鮮竹瀝原料藥8 批，由生產企業提供。乙酸銨為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗［6-10］

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.02 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～23 min，5%A；23～65 min，55%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm（苯甲酸、脫氫乙酸），256 nm（山梨酸、羥苯酯類）；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。在上述色譜條件下，9 種防腐劑的理論板數均大于3 000，分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備分別取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯、羥苯異丙酯和羥苯異丁酯對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL 各含16 μg 的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備精密吸取樣品1 mL，置100 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗按處方取各味藥材，按制法制備不含防腐劑的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制得陰性樣品溶液。取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液分別按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結果顯示陰性無干擾，圖譜見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.3.2 線性關系考察取各對照品適量，精密稱定，加水分別制成6 個質量濃度的系列溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件分析。以各防腐劑成分濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），擬合標準曲線并進行回歸分析。結果顯示，各防腐劑成分在各自濃度范圍內線性關系良好。結果詳見表1。

表1 防腐劑線性關系

2.3.3 重復性試驗取樣品（批號B190708），平行精密量取6 份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，測得苯甲酸平均含量為0.29%，RSD 為0.6%，其余8 種防腐劑均未檢出，表明該方法重復性良好。

2.3.4 回收率試驗精密量取已知防腐劑含量的樣品6 份,加入混合對照品儲備液適量,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果表明該方法準確可靠，結果見表2。

表2 防腐劑回收率結果 %

2.3.5 檢出限取對照品溶液，逐級稀釋至各對照品色譜峰信噪比（S/N）為3∶1，作為該防腐劑成分的檢出濃度（μg/mL），分別計算檢出限，結果苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯甲酯的檢出限為0.001%，羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯、羥苯異丙酯、羥苯異丁酯的檢出限為0.002%。

2.3.6 穩定性試驗取同一混合對照品溶液，室溫下放置0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結果各防腐劑峰面積在48 h 內無明顯變化，表明被測溶液48 h 內穩定性較好。

2.3.7 耐用性試驗實驗選擇了三種不同品牌的色譜柱，分別為資生堂CAPCELL PAK C18（4.6mm×250mm，5 μm），Waters Sunfire C18 柱（4.6mm×250mm，5 μm）和依利特Supersil ODS2（4.6mm×250mm，5 μm），并取同一混合對照品溶液按“2.1”項下色譜條件進行分析測定。結果9 種防腐劑成分均分離良好且峰面積無明顯變化，表明該方法的耐用性較好。

2.4 樣品測定

取94 批次復方鮮竹瀝液樣品和8 批次鮮竹瀝原料藥，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果94 批次復方鮮竹瀝液和8 批次鮮竹瀝原料藥均檢出苯甲酸。94 批次復方鮮竹瀝液苯甲酸含量為0.13%～0.30%，8 批次鮮竹瀝原料藥苯甲酸含量為0.07%～0.22%，均未檢出其余8 種防腐劑。

3 討論

3.1 色譜條件篩選

本實驗采用DAD 檢測器進行掃描，發現苯甲酸、脫氫乙酸在230 nm 處有最大吸收，山梨酸、羥苯酯類防腐劑在256 nm 有最大吸收。為滿足9個化合物檢測靈敏度的要求，確定苯甲酸、脫氫乙酸的檢測波長為230 nm，山梨酸、羥苯酯類的檢測波長為256 nm。實驗選擇甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨溶液作為流動相，考察了不同流動相比例的分離情況，最終確定按“2.1”項下色譜條件進行梯度洗脫。

3.2 測定結果分析

本品種質量標準收載于《中國藥典》2020 年版一部，質量標準制法項規定每1 000 mL 使用苯甲酸鈉3 g，且依據《中國藥典》2020 年版四部通則0181 合劑項下有關規定，山梨酸和苯甲酸的用量不得超過0.3%（其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計），羥苯酯類的用量不得超過0.05%［11］。對本次抽檢的6 家生產企業共94 批次樣品和8 批次鮮竹瀝原料藥進行防腐劑測定，結果顯示，各企業添加的防腐劑均符合《中國藥典》2020 年版一部、四部有關規定，表明本品種防腐劑的使用情況良好。

3.3 防腐劑抑菌效能及毒性探討

目前，中藥液體制劑生產實際中常用防腐劑為苯甲酸的鈉鹽和山梨酸的鉀鹽，其次為苯甲酸、山梨酸、尼泊金酯類防腐劑（羥苯酯類）。有文獻報道苯甲酸鈉防腐能力小于苯甲酸，苯甲酸防止發酵效果好，但苯甲酸毒性較大，因此苯甲酸的使用受到了爭議，許多國家也已禁止使用［8］；山梨酸防腐能力強；尼泊金酯類防腐劑（羥苯酯類）防霉作用強、用量小，是大眾認可的毒性較低的防腐劑。另外，防腐劑的聯合應用可增強防腐和抑菌效能，是解決防腐劑使用過量的途徑之一，應推廣應用［12-14］。

4 結論

本實驗建立HPLC-DAD 法同時測定復方鮮竹瀝液中9 種防腐劑的含量,該方法準確可靠、耐用性較好，可用于該制劑的質量控制。