基于Box-Behnken 設計-響應面法優(yōu)化白斑酊浸漬工藝及其質(zhì)量標準的研究

王文，許時貴，付志媛，魏鑫華，張國松

1.江西省皮膚病專科醫(yī)院，江西省皮膚病臨床醫(yī)學研究中心，國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學研究中心分中心建設單位，江西 南昌 330001；2.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330006

白斑酊收載于南京市衛(wèi)生局主編的《醫(yī)院制劑規(guī)范》［1］，為臨床經(jīng)驗方，由補骨脂、菟絲子、梔子3 味中藥以1∶1∶1 的比例構成，主要用于治療白癜風［2-3］、皮膚白斑等。該處方在臨床上使用多年。使用本品時，需將相同重量的3 味藥材用適宜濃度的乙醇浸漬7～10 d 后方可使用，且浸漬時間長，操作煩瑣，患者依從性差。而且由于患者操作水平的不同，造成工藝不穩(wěn)定，藥品的質(zhì)量得不到保證，影響藥物療效。本研究根據(jù)白斑酊處方組成、有效成分的性質(zhì)，保持原劑型（酊劑）不變的情況下，使用單因素考察結合Box-Behnken 設計-響應面法進行實驗，優(yōu)化浸漬工藝，在保證原組方中治療疾病的物質(zhì)基礎未發(fā)生變化的情況下優(yōu)化了制劑生產(chǎn)工藝，保證了制劑的穩(wěn)定、安全、有效。

1 儀器和試藥

Agilent 1260 高效液相色譜儀（配備紫外檢測器，四元梯度泵，安捷倫數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)）。補骨脂素對照品（批號110739-200814）、異補骨脂素對照品（批號110738-200511）、梔子對照藥材（批號120986-201108）、梔子苷對照品（批號110749-200714）均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法和結果

2.1 浸漬工藝研究

2.1.1 補骨脂素和異補骨脂素含量測定方法補骨脂為該處方的君藥，是治療白癜風常用的中藥。其主要活性成分補骨脂素和異補骨脂素，具有較強鎮(zhèn)靜、解痙、止血等作用，是補骨脂治療白癜風的有效成分［4］。實驗以補骨脂素和異補骨脂素總轉移率為指標，進行浸漬工藝研究。

（1）色譜條件和系統(tǒng)適用性條件。色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（50∶50）；檢測波長：246 nm；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃。理論板數(shù)按補骨脂素峰計算不低于3 000。

（2）溶液制備。混合對照品溶液的制備：取補骨脂素對照品、異補骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含補骨脂素14.0 μg 和異補骨脂素16.4 μg 的混合溶液，即得；供試品溶液制備：精密量取浸漬液1 mL，置50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

（3）測定法。分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀，測定。

（4）陰性對照溶液的制備。處方中除去補骨脂的其余藥味按制劑工藝制備，制得供試品陰性對照，照供試品溶液制備的方法制得供試品陰性對照溶液。分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液與陰性對照溶液各10 μL，按上述色譜條件測定，結果陰性對照溶液色譜在與對照品溶液色譜和供試品色譜相應位置上無對應色譜峰出現(xiàn)，說明該方法專屬性良好，結果如圖1 所示。

圖1 高效液相色譜圖：A.供試品溶液；B.混合對照品溶液；C.陰性對照溶液

（5）線性范圍考察。精密吸取混合對照品溶液2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、15 μL、20 μL（分別含補骨脂素對照品0.028 μg、0.070 μg、0.112 μg、0.140 μg、0.210 μg、0.280 μg 和異補骨脂素對照品0.033 μg、0.082 μg、0.131 μg、0.164 μg、0.246 μg、0.328 μg）分別注入色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，并以峰面積（Y）對補骨脂素和異補骨脂素進樣量（X）進行回歸，得標準曲線。補骨脂素線性方程為：Y=8 985.5X-2.142 9，r=1.000 0；異補骨脂素線性方程為：Y=10 585X-4.643 7，r=1.000 0。表明補骨脂素和異補骨脂素在各自進樣量范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

（6）精密度試驗。精密吸取混合對照品溶液10 μL，重復進樣6 次,測得補骨脂素對照品峰面積平均值為1 257.25，RSD 為0.17%；測得異補骨脂素對照品峰面積平均值為1 732.97，RSD 為0.18%，說明該方法精密度良好。

（7）穩(wěn)定性試驗。取供試品溶液10 μL，按擬定的含量測定項下方法分別在0、2、4、8、16、24 h 測定，結果補骨脂素峰面積平均值為699.07，RSD（n=6）為0.53%；異補骨脂素峰面積平均值為604.86，RSD（n=6）為0.49%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

（8）重復性試驗。按擬定的含量測定方法，取同一批樣品平行制備6 份供試品溶液，測得補骨脂素峰面積平均值為696.88，RSD（n=6）為0.66%；異骨脂素峰面積平均值為600.74，RSD（n=6）為0.20%，表明方法重復性良好。

（9）加樣回收率試驗。取已知含量的樣品（補骨脂素和異補骨脂素含量分別為0.389 0 mg/mL、0.286 0 mg/mL）1 mL，精密加入補骨脂素對照品和異補骨脂素對照品混合溶液1 mL(補骨脂素濃度為0.392 2 mg/mL、異補骨脂素濃度為0.300 5 mg/mL)，按供試品制備與測定方法，平行做6 份，計算得補骨脂素回收率為101.75%，RSD 為0.63%；異補骨脂素回收率為101.21%，RSD 為0.36%，結果見表1、表2。說明該方法準確度良好。

表1 補骨脂素回收率測定結果

表2 異補骨脂素回收率測定結果

（10）補骨脂藥材含量測定。取補骨脂藥材粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取2 h，放冷，轉移至100 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。精密吸取10 μL 進樣，測得藥材中補骨脂素和異補骨脂素的總含量為1.26%。

2.1.2 單因素考察白斑酊處方為：補骨脂60 g、菟絲子60 g、梔子60 g。

（1）原料粉碎粒度。稱取處方飲片3 份，分別粉碎，過20 目、30 目、40 目篩，70%乙醇料液比9∶40，浸漬7 d，按上述方法測得浸漬液中補骨脂素和異補骨脂素總轉移率分別為43.37%、57.21%、68.35%。結果表明，隨著粉碎粒度增加，總轉移增加，確定粉碎過篩目數(shù)為40 目。

（2）浸漬溫度。稱取處方飲片3 份，粉碎，過40 目篩70%乙醇料液比9∶40，分別在20℃、30 ℃、40℃條件下浸漬7 d，按上述方法測得浸漬液中補骨脂素和異補骨脂素總轉移率分別為65.25%、65.38%、66.21%。結果表明，隨著浸漬溫度升高，總轉移無明顯變化，說明浸漬溫度對浸漬工藝的影響差異無統(tǒng)計學意義。

（3）乙醇濃度。稱取處方飲片5 份，粉碎過40 目篩，用濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%乙醇800 mL 浸漬7 d，按上述方法測得浸漬液中補骨脂素和異補骨脂素總轉移率分別為43.25%、62.03%、68.35%、68.56%、69.03%。結果表明，隨著乙醇濃度的升高，總轉移率升高，在60%后總轉移率基本不再增加，故乙醇濃度以60%、70%、80%為考察對象。

（4）料液比。稱取處方飲片5 份，粉碎過40目篩，分別用500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL 70%濃度的乙醇浸漬7 d，即料液比為9∶25、9∶30、9∶35、9∶40、9∶45，按上述方法測得浸漬液中補骨脂素和異補骨脂素總轉移率分別為43.13%、51.08%、68.55%、72.98%、78.25%。結果表明，隨著料液比的升高，總轉移率增加，在料液比9∶35 后總轉移率基本不再增加，故料液比以9∶35、9∶40、9∶45 為考察對象。

（5）浸漬時間。稱取處方飲片4 份，粉碎過40目篩，分別用700 mL 的70%濃度的乙醇浸漬5、7、9、11 d，按上述方法測得浸漬液中補骨脂素和異補骨脂素總轉移率分別為48.26%、68.55%、71.27%、72.43%。結果表明，隨著浸漬時間的增加，總轉移率增加，在7 d 后總轉移率基本不再增加，故浸漬時間以7、9、11 d 為考察對象。

2.1.3 Box-Behnken 設計-響應面法優(yōu)化浸漬工藝（1）響應面試驗設計與結果。在單因素實驗基礎上，原料粉碎過篩目數(shù)固定為40 目，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、浸漬時間（C）為自變量，每個自變量的低、中、高水平以-1、0、1 進行編碼，以補骨脂素和異補骨脂素總轉移率%（Y）為響應值，使用Design-Export.V12 軟件進行Box-Behnken 中心點試驗設計［5］，因素水平及編碼見表3，實驗安排及結果見表4。

表3 試驗因素水平

表4 響應面設計與結果

利用ANOVA 分析響應面回歸參數(shù)，采用Design-Export.V12 軟件對表6 數(shù)據(jù)進行多元線性回歸擬合，得二次多項回歸模型方程Y=77.26+2.47A+5.21B+2.44C+2.79AB-0.1975AC-0.57BC-3.27A2+3.04B2-4.58C2

（2）方差分析。經(jīng)過軟件分析，模型的F=5.91，P=0.014 3（P＜0.05），R2=88.38%，說明該模型擬合結果較為理想。通過分析A（乙醇濃度）、B（料液比）、C（浸漬時間）三因素對補骨脂素和異補骨脂素總轉移率的影響順序為B＞A＞C，其中，B 對結果的影響差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各因素交互影響的順序為AB＞BC＞AC，但其對結果影響差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。除了B 外，其他因素對該模型的影響差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），證明各項因素與補骨脂素和異補骨脂素總轉移率不是簡單的線性關系。失擬態(tài)F=5.95，P=0.087 3，表明無失擬因素存在。方差分析結果詳見表5。

表5 方差分析結果表

（3）浸漬工藝的響應面結果分析。根據(jù)實驗結果，進行回歸分析后，作出響應曲面圖，如圖2 所示。使用Design-Export.V12 對浸漬工藝的相關參數(shù)進行優(yōu)化，根據(jù)模型擬合結果，白斑酊浸漬工藝為加74.93%乙醇，料液比9∶45，浸漬9.28 d，此條件的總轉移率的預測值為87.463%。結合實際操作的可行性和簡便性，最終確定了其最佳浸漬工藝，70%乙醇，料液比9∶45，浸漬9 d。

圖2 ABC三因素對總轉移率的響應面圖

2.1.4 驗證實驗為了驗證優(yōu)化后工藝（70%乙醇，料液比9∶45，浸漬9 d）的可靠性及穩(wěn)定性，按處方比例，稱取藥材3 份，每份180 g，按優(yōu)化后工藝條件浸漬，按上述含量測定方法測定補骨脂素和異補骨脂素總量，計算補骨脂素和異補骨脂素總轉移率，結果見表6。

表6 工藝驗證結果表

結果表明，3 份驗證樣品的補骨脂素和異補骨脂素平均總轉移率為88.18%，工藝參數(shù)穩(wěn)定。

2.2 白斑酊的質(zhì)量標準研究

2.2.1 薄層色譜鑒別（1）方中補骨脂的薄層色譜鑒別，參考《中國藥典》2020 年版一部補骨脂【鑒別】項下方法及文獻資料對方中補骨脂進行鑒別［6-7］，以補骨脂素對照品和異補骨脂素對照品混合液為對照，結果供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，斑點清晰且對應良好，陰性無干擾（如圖3 所示）。

圖3 補骨脂薄層色譜（365 nm）

（2）方中梔子的薄層色譜鑒別，參考《中國藥典》2020 年版一部中梔子【鑒別】項下的薄層色譜方法進行鑒別［6］。結果供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，斑點清晰且對應良好，陰性無干擾（如圖4 所示）。

圖4 梔子薄層色譜顯色圖

2.2.2 含量測定取白斑酊的3 批中試產(chǎn)品同“2.1.3”項下補骨脂素和異補骨脂素的含量測定方法制備，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，按色譜條件測定。結果：白斑酊的3 批中試產(chǎn)品的補骨脂素和異補骨脂素總含量分別為：0.677 9 mg/mL、0.678 7 mg/mL、0.677 8 mg/mL。

3 討論

本次實驗以補骨脂素和異補骨脂素的總轉移率為指標，使用單因素考察結合Box-Behnken 設計-響應面法考察了白斑酊的最佳浸漬工藝，對其中的補骨脂及梔子進行了薄層色譜鑒別，并檢測了酊劑中補骨脂素和異補骨脂素總含量，為白斑酊品種的開發(fā)提供了依據(jù)。