甲狀腺微小乳頭狀癌hsa_circRNA_001059表達及其臨床價值研究

周聰 彭文 陳吉柏 吳乾富

甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarci‐noma，PTMC）是一種增長速度較快的常見惡性腫瘤，其甲狀腺癌原發病灶的最大徑≤1 cm。近年來，PTMC的發病率在全球范圍內有上升且呈年輕化趨勢，部分PTMC患者出現轉移、復發甚至死亡[1]。PTMC病灶隱匿，病程緩慢，對其診斷較為困難，常規超聲檢查方法已不能滿足臨床的需求。近年來研究發現，環狀RNA（circular RNA，circRNA）作為一種新出現的具有相對穩定結構的非編碼RNA，在惡性腫瘤中存在特異性表達，參與腫瘤細胞的增殖、浸潤、遷移和凋亡等過程，circRNA可能為PTMC的診斷和治療提供新思路[2-3]。有研究表明，hsa_circRNA_001059在PTMC患者中異常表達，其表達水平變化與PTMC轉移和復發有關，可能對預測PTMC的發生、發展有重要幫助[4]。然而，關于hsa_circRNA_001059在PTMC中的具體作用機制及其對PTMC的診斷價值尚未明確。基于此，本研究通過分析hsa_circRNA_001059在PTMC患者中的表達情況，探討其與PTMC患者頸部淋巴結轉移的關系，并分析其對PTMC的診斷價值，以期為PTMC的診療提供參考，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年1月至2021年5月儋州市人民醫院收治的PTMC患者102例（PTMC組）。納入標準：（1）PTMC經病理組織檢查確診，均行甲狀腺切除術；（2）年齡≥18歲，首次確診PTMC。排除標準：（1）術前已接受放療、化療或其他抗腫瘤治療者；（2）有頸部手術、頭頸部放療史，合并嚴重心肺、肝腎疾病及其他惡性腫瘤者。PTMC組男26例，女76例；年齡25～68（47.30±11.36）歲；頸部淋巴結轉移59例，無頸部淋巴結轉移43例。另選取同期50名在本院體檢正常者作為對照組，其中男15名，女35名；年齡28～65（46.52±10.17）歲。兩組性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。收集PTMC組患者PTMC組織與配對的癌旁正常組織作為研究材料。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒和Trizol試劑盒均購自美國Life Technologies公司，高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司。

1.2.2 PTMC組與對照組血漿hsa_circRNA_001059表達水平檢測 采集PTMC組患者術前、對照組體檢時空腹靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝管中，離心分離血漿，使用RT-PCR技術檢測血漿hsa_circRNA_001059表達水平，方法同1.2.4。

1.2.3 引物設計與合成 引物由上海生工生物公司設計與合成。hsa_circRNA_001059引物：上游：5'-ACT‐GCTGAGATCTGCTGAGAGCA-3'，下游：5'-TCGAGAG‐CACGAGTGCTATCG-3'；內參 GAPDH 上游：5'-TC‐CAATTCTGTCTAAGGAGAAT-3'，下游：5'-AACGAAGGCACTGCTATCAT-3'。

1.2.4 PTMC組織與癌旁正常組織hsa_circRNA_001059表達水平檢測 使用Trizol試劑提取組織總RNA，紫外分光光度法測量RNA的濃度。首先用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，獲取反轉錄脫氧核糖核酸，再使用ABI 7500型熒光定量PCR儀進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time PCR,RT-PCR）。PCR總反應體系為20 μl：1 μl引物及探針Mix（20×），10 μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μl反轉錄脫氧核糖核酸，7.67 μl雙蒸水。擴增反應條件為：95℃預變性5 min 1個循環，95℃變性15 s、60℃退火30 s，40個循環。以GAPDH為內參基因，采用 2-ΔΔCt法計算 hsa_circRNA_001059 表達水平。

1.3 觀察指標 （1）比較PTMC組與對照組血漿hsa_circRNA_001059表達水平；（2）比較PTMC組織與癌旁正常組織hsa_circRNA_001059表達水平；（3）比較PTMC頸部淋巴結轉移患者與無頸部淋巴結轉移患者癌組織、血漿hsa_circRNA_001059表達水平；（4）分析hsa_circRNA_001059表達水平對PTMC的診斷價值及對PTMC患者頸部淋巴結轉移的診斷價值。

1.4 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以±s表示，組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用ROC曲線分析hsa_circRNA_001059對PTMC及淋巴結轉移的診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTMC組與對照組血漿hsa_circRNA_001059表達水平比較 PTMC組患者血漿hsa_circRNA_001059表達水平為2.40±1.02，明顯高于對照組的0.74±0.16，差異有統計學意義（t=14.811，P＜0.05）。見圖1。

圖1 PTMC組與對照組血漿hsa_circRNA_001059表達水平比較

2.2 PTMC組織與癌旁正常組織hsa_circRNA_001059表達水平比較 PTMC組織hsa_circRNA_001059表達水平為2.87±1.15，明顯高于癌旁正常組織的0.81±0.20，差異有統計學意義（t=17.835，P＜0.05）。見圖2。

圖2 PTMC組織與癌旁正常組織hsa_circRNA_001059表達水平比較

2.3 PTMC頸部淋巴結轉移患者與無頸部淋巴結轉移患者癌組織、血漿hsa_circRNA_001059表達水平比較 PTMC頸部淋巴結轉移患者癌組織、血漿hsa_cir‐cRNA_001059表達水平均高于無頸部淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 PTMC頸部淋巴結轉移患者與無頸部淋巴結轉移患者癌組織、血漿hsa_circRNA_001059表達水平比較

2.4 hsa_circRNA_001059表達水平對PTMC的診斷價值 ROC曲線分析顯示，癌組織、血漿hsa_circRNA_001059診斷PTMC的最佳截斷值為1.72、1.50，AUC為0.855（95%CI：0.794～0.912）、0.813（95%CI：0.755～0.874），靈敏度為 0.830、0.816，特異度為0.857、0.782。見表2和圖3。

圖3 hsa_circRNA_001059表達水平診斷PTMC的ROC曲線

表2 hsa_circRNA_001059表達水平對PTMC的診斷價值分析

2.5 hsa_circRNA_001059表達水平對PTMC患者頸部淋巴結轉移的診斷價值 ROC曲線分析顯示，癌組織、血漿hsa_circRNA_001059診斷PTMC患者頸部淋巴結轉移的最佳截斷值為3.17、2.65，AUC為0.894（95%CI：0.836～0.957）、0.860（95%CI：0.802～0.924），靈敏度為0.830、0.816，特異度為0.882、0.863。見表3和圖4。

圖4 hsa_circRNA_001059診斷PTMC患者淋巴結轉移的ROC曲線

表3 hsa_circRNA_001059表達水平對PTMC患者頸部淋巴結轉移的診斷價值分析

3 討論

PTMC是內分泌系統常見的惡性腫瘤之一，尋找一種簡單、快速的分子標志物，早期診斷PTMC、早期發現淋巴結轉移對改善PTMC患者的預后有重大益處。circRNA是一類單鏈共價閉合非編碼RNA，具有細胞特異性、組織特異性和時間特異性，與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，可為惡性腫瘤的早期診斷、預后評估及臨床治療提供幫助[5-6]。Fan等[7]研究表明，hsa_circRNA_0000144在甲狀腺癌組織中異常高表達，能促進細胞增殖、遷移和侵襲，有望成為甲狀腺癌早期診斷、療效監測及靶向治療的潛在分子標志物。另有研究認為，hsa_circRNA_0058124作為一種致癌驅動因子，促進甲狀腺乳頭狀癌的細胞增殖、致瘤性、腫瘤侵襲和轉移，對腫瘤的發生和侵襲至關重要，可能是一個干預甲狀腺乳頭狀癌進展的新的治療靶點[8]。

本研究顯示，PTMC組織hsa_circRNA_001059表達水平明顯高于癌旁正常組織，PTMC組血漿hsa_cir‐cRNA_001059表達水平明顯高于對照組，提示hsa_cir‐cRNA_001059在PTMC患者中存在異常高表達，其可能通過發揮癌基因的作用來參與PTMC的發病過程。Cai等[9]研究發現，癌組織中circRNA水平明顯高于癌旁組織，circRNA促進癌細胞增殖、遷移和侵襲，與甲狀腺乳頭狀癌發病密切相關。本研究中淋巴結轉移患者癌組織、血漿hsa_circRNA_001059表達水平均明顯高于無淋巴結轉移患者，提示hsa_circRNA_001059高表達與PTMC患者的淋巴結轉移有關，可促進PTMC的病情進展。Guo等[10]研究指出，與正常組織相比，腫瘤組織中circRNA存在異常表達，circRNA可能參與了腫瘤的發生、發展，可能是甲狀腺乳頭狀癌診斷和進展評價的新型臨床標記物。Li等[11]研究表明，circRNA作為腫瘤發生的關鍵調控因子,在PTMC的發生、發展、侵襲和轉移中起著重要作用，是PTMC遠處轉移的潛在標志物，對預后有重要影響。由此推測，hsa_cir‐cRNA_001059作為促癌因子，可通過調控癌細胞的增殖、轉移、凋亡、自噬等生物學行為，參與PTMC的惡性進展。

本研究ROC曲線分析顯示，血漿和組織hsa_cir‐cRNA_001059表達水平診斷PTMC的AUC均＞0.800，而且血漿和癌組織hsa_circRNA_001059表達水平診斷PTMC患者淋巴結轉移AUC也均＞0.800，說明無論采集血漿還是癌組織，hsa_circRNA_001059對PTMC診斷及預測其淋巴結轉移的效能均較高，hsa_circRNA_001059有望作為PTMC診斷及預測其淋巴結轉移的分子標志物。由此可見，癌組織或血液中hsa_circRNA_001059高表達與PTMC發展有關，本研究通過采集PT‐MC患者術中癌組織、癌旁正常組織和術前血液進行hsa_circRNA_001059檢測，對PTMC診斷及預測其淋巴結轉移具有較好的幫助，也為其治療提供了新的方向。有研究顯示，血清circRNA在PTMC淋巴結轉移患者中高表達，與淋巴結轉移發生密切相關，可能是術前預測PTMC發生淋巴結轉移的生物標志物[12]。Borran等[13]研究表明，circRNA參與甲狀腺癌的基因調控，是一種有前途的甲狀腺癌無創性分子標志物，為甲狀腺癌的診斷和治療提供了一個新的潛在分子靶點。

綜上所述，PTMC患者癌組織和血漿hsa_circRNA_001059表達水平明顯升高，其高表達與PTMC患者淋巴結轉移有關，對診斷PTMC及淋巴結轉移有較好的臨床價值，可為PTMC的早期發現、早期治療提供幫助。