凋亡相關蛋白酶Caspase-10在早期妊娠丟失患者蛻膜組織中的表達研究

俞田田 洪麗華 楊東見 范建霞

人類生殖是哺乳動物物種中最低效的，近15.3%的妊娠會發生自然流產[1]。妊娠流產相關文獻報道，孕12周前即妊娠早期發生流產的概率較高[1-2]。早期妊娠丟失（early pregnancy loss,EPL）是孕期常見的并發癥之一，是一個多因素參與的過程，其發病機制目前仍不明確，常規產前檢測無法預測。研究EPL病因、病理生理機制、預防自然流產等不良妊娠結局有重要意義。Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一種促細胞凋亡的蛋白酶[3]。近年來發現的Caspase-10是一類含有死亡效應結構域的凋亡蛋白酶，Park等[4]研究指出Caspase-10極有可能是細胞凋亡的內源性啟動分子。Caspase-10的功能異常與許多疾病的發生、發展有密切的關系[5-8]，但其在EPL中的相關研究報道不多。筆者團隊前期研究發現，采用miRNAs array芯片檢測EPL患者蛻膜組織中的差異表達miRNAs，通過生物信息學方法預測出3個下調miRNAs（miR-378a-3p、miR-422a、miR-378a-5p）同時靶向Caspase-10。基于此，本研究對Caspase-10在EPL患者蛻膜組織中進行Western blot和免疫組化實驗驗證，以期為進一步研究EPL的病因和機制提供參考，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2020年10至12月在上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院計劃生育門診手術室行早孕人工流產手術的患者40例，收集廢棄的流產蛻膜組織。患者平均年齡28.7歲，均為孕6～8周。其中EPL接受人工流產手術者20例，為EPL組；正常早孕要求終止妊娠行人工流產者20例，為對照組。EPL組納入標準：（1）20～40歲健康女性，此次早孕B超檢查提示宮腔內未見孕囊或未見胎心搏動；（2）平素月經規律，排除此次早孕期藥物保胎治療的患者；（3）排除復發性流產患者；（4）染色體芯片檢查排除此次難免流產由絨毛染色體異常引起；（5）排除因生殖道畸形、自身免疫系統疾病、創傷等導致的流產；（6）排除吸煙酗酒史。對照組納入標準：（1）20～40歲健康女性，此次早孕B超檢查提示宮腔內見孕囊、胚芽及胎心搏動；（2）平素月經規律，無重大疾病史、自身免疫系統疾病、內分泌疾病或激素藥物服用史；（3）本次妊娠無先兆流產癥狀；（4）排除吸煙酗酒史。EPL組患者年齡（28.75±0.90）歲，孕齡（45.55±1.14）d；對照組患者年齡（28.60±0.70）歲，孕齡（47.00±1.11）d。本研究經上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院醫學倫理委員會批準，標本的獲取經患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 miRNAs array芯片檢測和靶基因預測 具體方法參照已發表文獻[9]，檢測EPL患者蛻膜組織中的差異表達miRNAs，并通過生物信息學方法預測靶基因。

1.2.2 蛻膜組織Caspase-10蛋白表達定量檢測

1.2.2.1 主要試劑 兔抗人Caspase-10多克隆抗體（中國Proteintech公司，貨號：14311-1-AP）;鼠抗人βctin單克隆抗體（中國Proteintech公司，貨號：66009-1-Ig）；山羊抗鼠IgG（H+L）二抗（美國Invitrogen公司，貨號：C31430100）；山羊抗免IgG（H+L）二抗（美國Invitro‐gen公司，貨號：C31460100）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司，貨號：23227）；PVDF膜（美國Millipore公司，貨號：IPVH00010）；ECL顯色試劑盒（美國Pierce公司，貨號：32132）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZLI-9018）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：PV-9001）。

1.2.2.2 Western blot法定量檢測蛻膜組織Caspase-10蛋白表達水平

1.2.2.2.1 組織蛋白質提取 蛻膜組織用PBS沖洗，加入含1%蛋白酶抑制劑（phenylmethylsulphonyl fluoride，PMSF）的蛋白裂解液，冰浴中充分勻漿，冰上靜置40 min。15 000 r/min，4℃離心30 min。將離心后的上清液轉移到1.5 ml離心管中，凍存于-80℃環境中備用。蛋白質含量的測定采用BCA法。

1.2.2.2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳（so‐dium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 按照蛋白裂解液說明書抽提、濃縮得到組織的蛋白樣本，采用SDS-PAGE，蛋白樣本電泳后，轉到PVDF膜上，加入封閉液，室溫、水平搖床上孵育l h；加入Caspase-10抗體（1∶1 000，用封閉液稀釋）、βactin抗體（1∶5 000,用封閉液稀釋），4℃過夜，分別加入二抗（1∶5 000稀釋），室溫避光孵育1 h后，增強化學發光（enhanced chemiluminescence,ECL）法顯影，細胞蛋白條帶的灰度值用Image J圖像分析軟件分析，以Caspase-10蛋白與β-actin的灰度值的比值作為Cas‐pase-10蛋白的表達水平。

1.2.3 免疫組化法半定量檢測蛻膜組織Caspase-10蛋白表達情況

1.2.3.1 免疫組化步驟 蛻膜組織標本均經10%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋。切片經二甲苯脫蠟及梯度乙醇至水化；按抗體說明書進行檸檬酸鹽（1∶100稀釋，pH=6）高溫高壓修復；3%H2O2抑制內源性過氧化物酶；5%山羊血清工作液封閉。滴加適當濃度的一抗工作液（1∶100），4℃冰箱孵育過夜；按試劑盒說明書辣根過氧化物酶標記二抗（1∶100,5%山羊血清工作液）；滴加DAB顯色。對照設計：以非免疫正常山羊血清代替一抗作為陰性對照。

1.2.3.2 免疫組化分析 采用組織學積分H-score方法進行半定量分析，采用雙盲法對每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，根據細胞染色強度分為4級。（1）陰性：細胞無染色或呈均勻一致淺黃色，與背景一致，計0分。（2）弱陽性：細胞顯色為淡黃色顆粒，明顯高于背景，計1分。（3）中度陽性：細胞顯色為棕黃色，計2分。（4）強陽性：細胞顯色為棕褐色，計3分。計算每張切片的平均染色強度得分（H-score），計算公式H-score=∑（I×F）。I為染色強度，F為每一強度級別的細胞數所占百分比。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 9.0統計軟件。正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。非正態分布的計量資料以M（P25,P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 下調差異表達miRNAs預測靶基因Caspase-10的功能分析 本實驗根據前期基因芯片結果，結合基因功能富集（gene ontology,GO）分析和靶基因信號轉導通路富集（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）分析，構建一個EPL患者蛻膜組織中與凋亡功能相關的miRNA與相應靶基因的調控網絡。結果顯示，3個下調差異表達miRNAs，包括miR-378a-3p、miR-422a、miR-378a-5p同時靶向 Caspase-10。通過DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov）靶基因功能分析網站，發現Caspase-10對細胞凋亡的調控是通過細胞內吞、誘導細胞外信號、蛋白水解、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、T細胞受體信號通路、Jak-STAT信號通路、Wnt信號通路、Hedgehog信號通路等經典信號通路參與慢性粒細胞性白血病、腎細胞癌、小細胞肺癌等多種癌癥及凋亡的發生、發展。GO分析結果見表1、圖1；KEGG分析結果見表2、圖2。

圖1 下調差異表達miRNA靶基因Caspase-10可能參與的生物學過程GO分析

圖2 下調差異表達miRNA靶基因Caspase-10可能參與的信號通路KEGG分析

表1 下調差異表達miRNA靶基因Caspase-10的GO分析結果

表2 下調差異表達miRNA靶基因Caspase-10的KEGG分析結果

2.2 EPL組與對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達水平比較 EPL組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達水平高于對照組（P＜0.05），見圖3、4。

圖3 EPL組和對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達電泳圖

圖4 EPL組與對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達水平的點狀箱式分析圖

2.3 EPL組與對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達情況比較 EPL組患者蛻膜組織Caspase-10在蛻膜細胞、腺上皮和腔上皮細胞中強陽性表達，并且主要表達在細胞的胞質中，而在對照組中弱陽性表達。通過H-score統計學分析得出，EPL組患者蛻膜組織Caspase-10表達強度較對照組高（P＜0.05），見圖5（插頁）、6。

圖5 EPL組與對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達鏡下所見（免疫組化染色，×400）

圖6 EPL組與對照組患者蛻膜組織Caspase-10蛋白表達強度點狀箱式分析圖

3 討論

近年來，越來越多研究證實細胞凋亡在妊娠相關疾病中起重要調控作用[10-11]，在人類子宮內膜生理或病理性的調節及在胎盤發展中也起著關鍵作用[12-13]。研究者發現在EPL患者蛻膜組織中同樣存在細胞凋亡現象[14-16]，其發生機制被認為可能是各種炎癥因子等的作用下，蛻膜組織長期處于缺氧狀態，這種缺氧狀態可以促發多種細胞因子和蛋白酶等發生失代償性的異常表達，通過泛素-蛋白酶體通路降解，最終引發細胞凋亡，導致流產。

Caspases是一類半胱氨酸蛋白酶家族，凋亡Cas‐pases主要分為凋亡起始Caspases（Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10）和凋亡效應 Caspases（Cas‐pase-3、Caspase-6、Caspase-7）。有研究預測靶基因Caspase-10是 Caspase-3的引發物，Caspase-3是Cas‐pase-10的執行蛋白[12]，Caspase-3需要通過Caspase-10的激活后啟動細胞凋亡。筆者團隊以往研究發現，在EPL患者蛻膜組織中，miR-378a-3p的下調增加Cas‐pase-3的表達，導致蛻膜組織細胞凋亡增加，影響了蛻膜細胞的功能，從而參與EPL的發生[15]。也有研究發現在早期自然流產患者的絨毛和蛻膜組織中均存在缺氧狀況，導致氧化應激反應增強，內質網應激的修復功能失代償，從而形成泛素化凋亡，特別是凋亡蛋白酶Cas‐pase-1、Caspase-4、Caspase-12發揮重要作用[14,17]。

Caspase-10為起始凋亡蛋白酶一種，因其在小鼠內缺乏，限制了科學家們對它的研究，至今鮮有Caspase-10在EPL中相關的研究報道。本實驗筆者團隊通過前期miRNAs array芯片篩查出來的下調差異表達miRNA與細胞凋亡相關的靶基因中發現，miR-378a-3p、miR-422a、miR-378a-5p同時靶向凋亡相關蛋白酶Caspase-10。且通過進一步發現，與選擇性流產患者蛻膜組織相比，Capasae-10蛋白在EPL患者蛻膜組織中表達明顯上調。同樣地，在免疫組化實驗中發現，EPL患者蛻膜組織中蛻膜細胞、腺上皮及腔上皮細胞中有較多的棕色或黃色Caspase-10表達顆粒，但在選擇性流產蛻膜組織中棕色或黃色表達顆粒不明顯，并且通過H-score統計學分析得出Caspase-10表達在EPL患者蛻膜組織中表達強度增高，進一步驗證了前期芯片結果。

本研究結果表明Caspase-10在EPL患者蛻膜組織中異常上調表達，提示下調差異表達miRNAs（miR-378a-3p、miR-422a、miR-378a-5p）可能通過直接靶向Caspase-10，導致蛻膜細胞凋亡，繼而導致流產發生。

綜上所述，本研究成功建立并預測EPL患者蛻膜組織中與凋亡蛋白相關的miRNA表達譜，并且靶向到凋亡相關蛋白酶Caspase-10，同時對Caspase-10在EPL患者蛻膜組織中進行Westren blot實驗和免疫組化實驗驗證。這一結果有望為EPL的發病機制研究提供參考。