FAM83H 及其天然反義轉錄本FAM83H-AS1在肺腺癌和卵巢癌發生發展中的作用

劉夢真 孫蓉蓉 劉艷華 張有為

1.徐州醫科大學臨床學院，江蘇徐州 221009；2.江蘇省徐州市中心醫院腫瘤內科，江蘇徐州 221009

惡性腫瘤已成為我國居民的主要死因，探索腫瘤發生發展中的關鍵基因具有重要意義[1]。FAM83H 位于染色體8q24.3，是FAM83 家族成員之一，最初因其在牙齒發育中的重要作用被關注，FAM83H 在肝細胞癌、腎癌、胃癌、胰腺癌和宮頸癌等腫瘤中高表達，并促進癌細胞的生長、侵襲和轉移[2-6]。FAM83H-AS1 位于FAM83H 的對側，是其天然反義轉錄本，二者以頭對頭（5’-5’）形式互補重疊。研究表明，FAM83H-AS1 是多種腫瘤潛在的診斷、預后標志物和治療靶點[7-9]。本研究擬在泛癌種水平研究FAM83H 和FAM83H-AS1 在腫瘤發生發展中的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CCK-8 購于Signalway Antibody（CP002）；Transwell小室購于Costar（3422）；Trizol 購于美國Invitrogen 公司（1596026）；逆轉錄試劑盒購于Fermentas（#K1622）；SYBR Green PCR 試劑盒（#K0223）、BCA 蛋白定量試劑盒（PICPI23223）、兔抗人FAM83H 多克隆抗體（PA5-55094）購于Thermo；兔抗人GAPDH 單克隆抗體（#5174）購于CST；羊抗兔HRP 標記二抗（A0208）、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（C1036）購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 生物信息學分析

在線分析FAM83H 基因在惡性腫瘤中的表達及預后，測試數據集來自基因表達譜動態分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）工具（http：//gepia2.cancer-pku.cn）[10]。

1.3 細胞培養和轉染

siFAM83H 與siFAM83H-AS1 干涉載體由上海基爾頓生物公司構建。A549、SKOV3 細胞均用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基在37℃，5%CO2培養箱中培養。取對數生長期的細胞進行轉染，分為空載對照組（siNC 組）和實驗組（siFAM83H 組、siFAM83H-AS1組），同時設置空白對照組（control 組），細胞轉染利用脂質體Lipofectamine 2000（美國Invitrogen 公司）介導的方法，轉染48 h 后進行后續實驗。本研究所有實驗步驟均重復3 次。

1.4 Real-time PCR 實驗

胰酶消化并收集各組細胞，Trizol 試劑盒提取總RNA，并對提取的RNA 進行濃度和純度檢測。在37℃60 min、85℃5 min、4℃5 min 的條件下，將RNA 逆轉錄合成cDNA。將合成的cDNA 按Real-time PCR 試劑盒說明書進行擴增，PCR 擴增：95℃10 min（95℃15 s，60℃45 s），40 個循環；熔解曲線：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s；以GAPDH 作為內參，檢測FAM83H、FAM83H-AS1 的表達。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot 檢測

RIPA 法提取細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。上樣后SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，二抗（1∶1 000）37℃孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，ECL 系統顯影（GAPDH 作內參）。

1.6 CCK-8 檢測細胞增殖

胰酶消化細胞，鏡下記數將細胞懸液濃度調整為3×104個/ml。按3×103個/孔，將細胞種至96 孔培養板，設置3 個復孔。在轉染0、24、48、72 h 后，加入CCK-8 試劑，酶標儀檢測細胞在450 nm 波長下的吸光度值。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

轉染后的細胞用胰酶消化，計數后制備成1×106個/ml的細胞懸液，取1 ml 懸液離心收集細胞，Annexin V-FITC 結合液重懸細胞，4℃避光孵育15 min后，加入碘化丙啶染色液，4℃避光孵育5 min 后，進行流式細胞儀檢測。

1.8 Transwll 檢測細胞遷移

胰酶消化細胞，用含1% FBS 的培養基制備3×105個/ml 的細胞懸液，每個Transwell 小室接種300 μl細胞懸液，下層加入700 μl 的含10% FBS 的培養基，每組細胞設置3 個復孔。培養24 h 后，取出小室，PBS 清洗2 次，甲醛固定10 min，PBS 洗滌2 次，0.5%結晶紫染色30 min，PBS 洗滌3 次，晾干后于顯微鏡下觀察拍照（200×），計數不同視野下的細胞數取平均值。

1.9 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；計數資料用百分率表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FAM83H、FAM83H-AS1mRNA 在泛癌種水平的表達

GEPIA 在線工具分析結果顯示，FAM83H mRNA在乳腺浸潤癌、胸腺瘤、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、肺鱗癌、肝細胞癌、胃癌、胰腺癌、結腸癌、膀胱尿路上皮癌、直腸癌、宮頸鱗癌和腺癌、子宮內膜癌和子宮肉瘤、卵巢漿液性囊腺瘤（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）中表達上調；在多形成性膠質細胞瘤、急性髓系白血病和皮膚黑色素瘤中表達下調。FAM83H-AS1 mRNA 在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、宮頸鱗癌和腺癌、結腸癌、LUAD、肺鱗癌、OV、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、胃癌、子宮內膜癌和子宮肉瘤中表達上調，在急性髓系白血病、皮膚黑色素瘤和睪丸癌中表達下調。見圖1。

圖1 FAM83H、FAM83H-AS1 mRNA 在泛癌種水平的表達

2.2 FAM83H、FAM83H-AS1 mRNA 表達與LUAD和OV 的預后

在LUAD 中，FAM83HmRNA 高表達組與低表達組生存曲線比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 FAM83H、FAM83H-AS1 mRNA 表達與LUAD 和OV 的預后

2.3 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組FAM83H、FAM83H-AS1 表達比較

A549 和SKOV3 細胞中，siFAM83H 組FAM83H mRNA 及蛋白表達低于siNC 組（P＜0.05）；siFAM83HAS1 組FAM83H-AS1 mRNA 表達低于siNC 組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組FAM83H、FAM83H-AS1 表達比較（n＝3）

2.4 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組細胞增殖能力比較

A549 和SKOV3 細胞中，siFAM83H 組轉染24、48、72 h 后細胞增殖能力低于siNC 組（P＜0.05）。siFAM83H-AS1 組轉染24、48、72 h 后細胞增殖能力低于siNC 組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后細胞增殖能力比較（n＝3）

2.5 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組細胞凋亡數量比較

A549 和SKOV3 細胞中，siFAM83H 組、siFAM83HAS1 組凋亡數量高于siNC 組（P＜0.05）。見圖5。

圖5 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組流式結果

2.6 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組細胞遷移數比較

A549 和SKOV3 細胞中，siFAM83H 組、siFAM83HAS1 組細胞遷移數低于siNC 組（P＜0.05）。見圖6。

圖6 FAM83H、FAM83H-AS1 敲低后各組Transwll 檢測結果（結晶紫染色，200×）

2.7 FAM83H、FAM83H-AS1 表達的關聯性

FAM83H 與FAM83H-AS1 以頭對頭（5’-5’）形式互補重疊，推測二者存在相互調控關系。A549 和SKOV3細胞中，FAM83H 后敲低，siFAM83H 組 與siNC 組siFAM83H-AS1 mRNA 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；FAM83H-AS1 敲低后，siFAM83H-AS1 組 與siNC 組siFAM83HmRNA 和蛋白比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖7。尚不能認為FAM83H 與FAM83HAS1 之間存在調控關系。

圖7 FAM83H、FAM83H-AS1 表達的關聯性（n＝3）

3 討論

本研究結果顯示，FAM83H 和FAM83H-AS1 在多種腫瘤中上調，敲低FAM83H 或FAM83H-AS1 后，可抑制A549、SKOV3 細胞增殖和遷移，誘導細胞凋亡。提示二者在LUAD 和卵巢癌中具有癌基因的作用。

既往研究證實，FAM83H 基因在人類多種腫瘤中表達上調，且與不良預后相關，其機制涉及不同信號通路[11-13]。肝細胞癌中FAM83H 誘導細胞周期蛋白和基質金屬蛋白酶-2 表達，癌基因MYC 結合到FAM83H 啟動子區，促進其轉錄[2]；胃癌中FAM83H 與Scrib 表達密切相關，FAM83H 和Scrib 可能通過穩定β-catenin 參與胃癌的進展[4]；胰腺癌中FAM83H 過表達與CD8+T 細胞浸潤減少及Ras-PI3K-mTOR 信號通路有關[5]；FAM83H 在非小細胞肺癌組織中的表達增加，與患者的臨床分期密切相關[14]。但FAM83H在卵巢癌中的表達尚未見報道，而本研究首次明確FAM83H 在LUAD 和卵巢中的生物學功能。

FAM83H-AS1 作為FAM83H 的天然反義轉錄本，其表達升高促進腫瘤發生發展[15-17]。FAM83H-AS1是LUAD 組織明顯上調的長鏈非編碼RNA 之一，FAM83H-AS1 通過調控Met/EGFR 信號，促進肺癌細胞增殖、侵襲和轉移[18]；FAM83H-AS1 還可以結合hnRNP K 以增強抗凋亡基因RAB8B 和RAB14 的翻譯，從而抑制LUAD 凋亡[19]。FAM83H-AS1 在卵巢癌組織中高表達，其表達水平與巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等免疫細胞浸潤程度相關，下調其表達可明顯抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲[20-21]；此外，FAM83HAS1 通過穩定HUR 蛋白參與卵巢癌的輻射抵抗和細胞轉移[22]。本研究進一步證實FAM83H-AS1 在LUAD和卵巢癌中的生物學功能。

有研究報道，內源性反義長鏈非編碼RNA 參與人類細胞基因表達的表觀遺傳調控[23]，其表達水平與宿主基因的表達水平呈正相關或負相關，提示編碼和非編碼轉錄本在特定的生物學途徑中存在協同調節[24]。在食管癌中，FAM83H-AS1 與其正義鏈FAM83H在轉錄和翻譯水平上存在一致性調節，FAM83H-AS1可能通過調控FAM83H 的表達而發揮癌基因作用[25]。盡管FAM83H 與FAM83H-AS1 在泛癌種水平的表達趨向一致，但是本研究未在細胞水平證實二者對彼此表達的影響，FAM83H 與FAM83H-AS1 可能獨立發揮作用，具體機制仍待進一步研究。