HIF-1α與Glut-1在大腸癌中表達及與脈管侵犯的關系

賈永恒 姜濤

(吉林大學中日聯誼醫院肝膽胰外科，吉林 長春 130033)

大腸癌是我國臨床常見的消化道腫瘤之一，是世界第三大惡性腫瘤〔1,2〕。大腸癌包括結腸癌和直腸癌。近年來，盡管隨著醫療技術的改革與創新，大腸癌患者的生存時間有所延長，但術后5年生存率仍然較低，僅約50%〔3〕。目前，大腸癌的主要病因及發病機制仍不清楚，多種分子在大腸癌的發生、發展和轉移等方面發揮重要作用。伴隨著基因組計劃的完成，基因轉錄、蛋白修飾等生物學過程在分子水平層面的研究受到越來越多學者的重視。腫瘤的發生發展中，常常伴隨著腫瘤細胞不斷生長，其惡性程度逐漸增高，氧的需求大于自身血管供應后，引起腫瘤局部缺氧的微環境狀態。而腫瘤細胞可以通過自我調整適應這種缺氧狀態，通過某些分子作用，促進腫瘤發展〔4〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α可通過轉錄調節對細胞缺氧產生適應〔5〕。惡性腫瘤細胞相比較于正常細胞，代謝率較高。腫瘤能量來源中大部分為葡萄糖，因此葡萄糖的膜轉運過程十分重要，葡萄糖轉運蛋白(Glut)-1在細胞膜上進行雙向轉運，在腫瘤的發展中起到關鍵作用〔6〕。目前研究已經發現HIF-1α和Glut-1在多種惡性腫瘤中高表達，參與腫瘤發展〔7,8〕。而對于HIF-1α和Glut-1在大腸癌中的表達及臨床意義仍然具有較多爭議，機制尚未明確。因此，本文主要探討HIF-1α和Glut-1在大腸癌中的表達及其與臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1病例資料 隨機選取2014年1月至2016年1月于吉林大學中日聯誼醫院胃腸結直腸肛門外科大腸癌患者32例，全部患者均行根治性大腸癌手術，術前未給予任何抗腫瘤治療，術后1 h內獲取病理標本及癌旁組織，存于液氮后制作成石蠟標本保存。本研究經過吉林大學中日聯誼醫院倫理委員會批準，并與患者及家屬簽署知情同意書。

1.2納入及排除標準 納入標準：患者術前行腸鏡檢查獲取病理標本，明確診斷為原發性大腸癌；術前未給予放療、化療等抗腫瘤治療；未發生遠處轉移的大腸癌患者；患者病例資料完整。排除標準：伴有嚴重高血壓、嚴重心臟疾病等其他嚴重器質性疾病的患者；腫瘤復發再次切除者。

1.3免疫組化 10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。用80℃烤箱對切片進行烘烤30 min，乙醇進行脫水，并使內源性過氧化物酶滅活，應用枸櫞酸緩沖液行高溫高壓水化修復過程；PBS洗3次，加入一抗50 μl，溫度控制于4℃一夜；再用PBS洗3次，加入二抗50 μl。室溫下二氨基聯苯胺(DAB)顯色，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，蘇木素輕度復染，樹膠行封片處理，光鏡下觀察。

1.4結果判定 兩名病理科醫師獨立觀察切片，有爭議的免疫組化結果由第三名病理醫師進行評估。光鏡下，以癌旁組織作為對照，HIF-1α陽性取決于細胞質中著色的棕黃色顆粒；Glut-1陽性定義為細胞膜、細胞質中著色的棕黃色顆粒。每個切片隨機觀察10個視野(每個視野計100個腫瘤細胞)，計算陽性表達率，陽性表達率<25%為陰性，≥25%為陽性。

1.5統計方法 采用SPSS23.0統計學軟件進行數據分析，計量資料服從正態分布的采用t檢驗，非正態分布的采用非參數檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗校正，采用Logistic回歸進行相關性分析。

2 結 果

2.1HIF-1α、Glut-1在大腸癌中的表達及與臨床病理特征的關系 通過免疫組化發現HIF-1α在大腸癌中陽性表達率為42.7%；Glut-1在大腸癌中陽性表達率為53.1%。HIF-1α的表達與脈管侵犯關系密切，差異有統計學意義(P=0.027)；與性別、年齡、分化程度，浸潤深度、神經侵犯及淋巴轉移這些病理特征無關。同樣發現，Glut-1的表達與脈管侵犯有關，差異有統計學差異(P=0.028)；與其他臨床病理特征間無統計學差異(P>0.05)。HIF-1α及Glut-1的表達與腫瘤的脈管侵犯密切相關。見表1，圖1。

圖1 大腸癌組織中HIF-1α、Glut-1表達(DAB，×100)

表1 HIF-1α與Glut-1的陽性表達與臨床病理特征的關系(n)

2.2HIF-1α、Glut-1在大腸癌中表達的相關性 32例大腸癌患者中，Glut-1表達陽性共17例，其中14例HIF-1α表達陽性，HIF-1α及Glut-1在大腸癌中的表達關系密切，呈強正相關性(r=0.828，P<0.001)。

3 討 論

HIF是一種異源二聚體轉錄因子，具有α和β兩部分。HIF-α為活性亞基，HIF-β為結構性亞基。前者通過HIF-1α來體現，后者在細胞內表達穩定〔9〕。在正常氧量條件下，在脯氨酰羥化酶(PHD)的作用下，HIF-1α被羥化，通過線粒體內的泛素蛋白酶結合泛素化進行降解。

HIF-1α作為缺氧適應性反應的主轉錄調節因子，缺氧狀態是其最強調節因素。缺氧情況下，羥化酶受到抑制，進而引起HIF-1α積累，并且通過與HIF-1β結合形成異源二聚體復合物〔10〕。復合物與目的基因啟動子缺氧反應元件(HRE)的核心DNA序列結合，激活轉錄輔助因子，同時與NCOA互相作用，導致活性增加。通過與氧化還原調控蛋白作用后，激活CTAD、NCOA、CREBBP等物質，進一步激活血管內皮生長因子(VEGF)、糖酵解酶等40余個基因，參與多種生物學過程。在實體腫瘤中，由于腫瘤細胞生長速度較快，超過血管生成速度，因此在腫瘤細胞內，乏氧狀態為其常見狀態。腫瘤細胞為適應缺氧情況，多種細胞因子表達增高，其中最重要的就是HIF-1α。目前已經證明HIF-1α在包括肺癌〔11〕、胃癌〔12〕、乳腺癌〔13〕等多種類型的腫瘤中過度表達。本研究發現，HIF-1α在大腸癌中陽性表達率為42.7%。HIF-1α的表達與脈管侵犯關系密切，與不同性別、年齡、腫瘤細胞分化程度、浸潤深度、神經侵犯及淋巴轉移這些病理特征無關。

葡萄糖為細胞進行代謝并產生能量的主要物質來源，參與多種細胞活動以及功能的調節。正常有氧條件下，葡萄糖通過轉化為丙酮酸后進入三羧酸循環，經過氧化磷酸化提供能量。但在缺氧條件下，主要提供能量的途徑更改為糖酵解途徑，僅少量丙酮酸經三羧酸循環供能。在整個供能過程中，葡萄糖轉運過程作用關鍵，Glut家族在此過程中起著關鍵作用。Glut-1為葡萄糖轉運蛋白家族的一員，參與多種生物學過程。Glut-1是第一個被描述的葡萄糖轉運因子，是組織細胞跨膜轉運葡萄糖的重要載體。Glut-1對葡萄糖具有強親和力，確保細胞在低濃度葡萄糖的狀態下，依然能夠轉運葡萄糖〔14〕。Glut-1在胚胎早期和哺乳期表達水平較高。哺乳后及成年以后，腦組織外，Glut-1表達明顯下降。但在惡性程度較高的腫瘤組織中，葡萄糖進入細胞內改變為一種被動過程，Glut-1的表達明顯增高，目的是將更多的葡萄糖跨細胞膜轉運入腫瘤細胞內，從而確保葡萄糖的攝取，促進葡萄糖的利用〔15〕。研究顯示，在肝癌〔16〕、胰腺癌〔17〕等有糖酵解機制的腫瘤中均表現出Glut-1過表達。本研究發現，Glut-1在大腸癌中陽性表達率為53.1%；Glut-1表達與脈管侵犯有關，與其他臨床病理特征無關(如性別、年齡、分化程度，浸潤深度、神經侵犯及淋巴轉移)。

Wincewicz等〔18〕研究發現HIF-1α與Glut-1在結腸癌腫瘤組織中表達增高，這一結論與我們的研究結論相一致，不同的是Wincewicz等〔18〕并未發現HIF-1α與Glut-1兩者的表達與脈管侵犯相關。武雪亮等〔19〕通過對50例結直腸癌患者腫瘤組織進行檢測，發現Glut-1、HIF-1α 的表達陽性率均與結直腸癌漿膜浸潤、分化程度、TNM 分期、淋巴轉移、肝轉移及脈管浸潤有關。在我們的研究中，并未發現HIF-1α與Glut-1的表達與不同性別、年齡、腫瘤細胞分化程度，浸潤深度、神經侵犯及淋巴轉移相關。Chen等〔20〕研究發現HIF-1α 在大腸癌腫瘤組織中顯著降低，而且與腫瘤浸潤深度、淋巴結受累和轉移顯著相關，認為HIF-1α在大腸癌的發生發展中起著抑癌作用。這一結果與我們的研究結果相矛盾。分析與以上結果不同的原因可能為樣本量及樣本質量的差異，同時納入標準間仍存在不同，需要通過擴大樣本量，同時進行細胞動物等實驗進一步確認以上實驗結果。

脈管侵犯是消化道腫瘤常見的臨床病理特征，主要是腫瘤細胞突破黏膜上皮侵入淋巴管和血管。侵入脈管的腫瘤細胞部分抵抗免疫系統的攻擊，與白細胞、血小板等形成聚合物，產生癌栓，加重腫瘤細胞缺氧狀態〔21〕。同時，新生淋巴管和血管產生，來適應腫瘤細胞的缺氧狀態及能量代謝。我們的研究發現HIF-1α與Glut-1的高表達均與大腸癌細胞的脈管侵犯密切相關。進一步通過數據分析，我們發現HIF-1α與Glut-1在大腸癌中的表達關系密切，呈強正相關。可能的機制為腫瘤情況下，大腸癌細胞處于缺氧及能量代謝異常情況，為適應缺氧HIF-1α 大量表達，產生多種細胞因子如VEGF，進而促進新生血管的生成，改善缺氧狀態。無氧糖酵解因素，Glut-1也出現大量表達，提高葡萄糖的利用，增加能量代謝。同時HIF-1α與Glut-1兩者具有協同作用，共同應對缺氧等異常情況的發生。

綜上所述，HIF-1α和Glut-1在大腸癌組織中的表達增高與腫瘤脈管侵犯有關，通過對兩者的研究，可以為大腸癌的診斷及治療提供指導依據。