老年重癥肌無力患者漿細胞樣樹突細胞與調節性T細胞的變化與臨床意義

王思微 牛韻婷 張婷婷

(1遼寧中醫藥大學附屬醫院臨床檢驗中心，遼寧 沈陽 110032；2沈陽醫學院)

重癥肌無力(MG)是一種機體產生抗神經肌肉接頭乙酰膽堿受體(AChR)抗體等自身抗體的自身免疫性疾病，導致神經遞質在突觸后膜傳遞障礙，出現骨骼肌疲勞的臨床表現，具有組織器官特異性〔1〕。其發病機制往往與機體的免疫功能失衡相關。調節性T細胞(Treg)是一種介導免疫耐受的CD4+細胞，其主要功能是通過控制T細胞的活化與增殖來抑制體內的免疫反應，使重癥肌無力的炎癥反應趨于慢性〔2〕。樹突細胞(DC)是一種專職抗原提呈細胞，在T細胞介導的免疫反應與免疫耐受環節有重要作用，根據不同來源與功能可分為髓樣DC(mDC)與漿細胞樣DC(pDC)，pDC可以誘導自然調節性T細胞(nTreg)的分化維持機體的自身免疫耐受，并誘導B細胞分化為漿細胞，與MG等自身免疫性疾病發生與發展有關，但研究甚少。本研究旨在分析MG患者外周血中pDC與Treg細胞的含量，探討其介導的免疫反應異常在MG患者中的表現。

1 資料與方法

1.1研究對象 2018年7月至2020年6月就診于遼寧中醫藥大學附屬醫院神經內科的老年初診并未接受治療的MG患者112例，其中男58例，女54例，年齡60～83歲，平均(72.85±8.13)歲。納入標準：患者均按照MG治療和診斷中國專家共識〔3〕明確診斷為MG；不合并其他自身免疫性疾病(如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎等)；不合并腫瘤、感染等疾??；無嚴重的心腦血管疾??；無精神類疾病能配合研究。將MG組分為無胸腺受累組60例與胸腺受累組52例(按照影像學與病理學診斷劃分)。按照MG定量評分(QMG)標準對患者進行評分。另外選取同期健康體檢人員68例為對照組，年齡61～78歲，男35例，女33例。3組性別、年齡無統計學差異，均知情同意，研究通過遼寧中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.2主要儀器與試劑 試劑：人外周血單個核細胞分離液，購自挪威Axis-Shield公司；人Treg試劑盒，熒光標記為Foxp3(PCH101)-APC，CD4-FITC，CD25-PE，購自eBioscience公司；熒光標記為Lin-1-FITC，CD123-PE，anti-HLA-DR-PerCP，CD11c-APC的單克隆抗體均購自美國BD公司；人乙酰膽堿受體抗體(AChR-Ab)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、人白細胞介素(IL)-4 ELISA試劑盒、人γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒，均購自南京森貝咖公司。設備：FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)，美國SpectraMax iD3多功能酶標儀。

1.3標本采集與處理 研究對象清晨空腹采集靜脈全血5 ml至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，用3 ml生理鹽水稀釋3 ml全血，室溫下在3 000 r/min離心力低速離心機中離心20 min，用潔凈吸管吸取中間層的淋巴細胞層，移至另一離心管中，用2倍體積的生理鹽水稀釋收集到的淋巴細胞，在1 500 r/min的離心力下，離心10 min，棄去上清，取沉淀，即為淋巴細胞，用于pDC與Treg細胞的檢測。另按上述條件采集5 ml全血，室溫13 000 r/min離心10 min，收集血清用于IL-4與IFN-γ的檢測。

1.4流式細胞術檢測pDC與Treg 將分離后的淋巴細胞懸液用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋濃度至1×106個ml。pDC的流式檢測：取流式專用潔凈試管加入稀釋好的淋巴細胞100 μl，加入Lin-1-FITC抗體20 μl，CD123-PE抗體10 μl，anti-HLA-DR-PerCP抗體10 μl，CD11c-APC抗體5 μl，渦旋震蕩混勻，室溫避光反應15 min，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，加入1 ml PBS洗滌細胞，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，加入300 μl PBS緩沖液混勻，準備上機操作。其中Lin-1-anti-HLA-DR+CD123+CD11c-的細胞群為pDC。Treg細胞的流式檢測：將100 μl稀釋好的懸液加入另一試管中，加入CD4-FITC、CD25-PE單克隆抗體各10 μl，渦旋震蕩混勻，室溫避光反應30 min，加入PBS 1 ml洗滌細胞，加入破膜劑250 μl，1 200 r/min離心5 min棄上清，加入Foxp3-APC抗體10 μl，加PBS 300 μl準備上機操作。應用四色流式細胞儀上機操作，應用BD CellQuest Pro分析軟件進行結果分析。

1.5ELISA檢測血清IL-4與IFN-γ 將收集好的血清用ELISA檢測IL-4與IFN-γ，操作均嚴格按照說明書進行，ELISA試劑盒采用五點定標，兩個濃度的質控品均在控，且具備符合檢測要求的線性條件及其他性能要求。

1.6統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、方差分析、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1各臨床資料比較 胸腺受累組及無胸腺受累組與對照組比較AChR-Ab含量較高，差異有統計學意義(P<0.05)；胸腺受累組較無胸腺受累組病程較長、QMG評分較高、AChR-Ab含量較高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2不同組別pDC、Treg、IL-4、IFN-γ的含量 胸腺受累組與對照組相比，pDC、Treg、IL-4含量明顯減低，IFN-γ含量明顯升高(P<0.05)；無胸腺受累組與對照組相比，pDC、Treg細胞含量明顯減低，IFN-γ含量明顯升高(P<0.05)；胸腺受累組與無胸腺受累組相比，pDC明顯減低，IFN-γ明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組臨床資料及pDC、Treg細胞，IL-4、IFN-γ含量比較

2.3各指標之間的相關性 Treg、IL-4與pDC呈正相關(r=0.840、0.780，P<0.05)，IFN-γ、QMG評分、AChR-Ab與pDC呈負相關(r=-0.773、-0.760、-0.816，P<0.05)；IFN-γ、QMG評分、AChR-Ab與Treg呈負相關(r=-0.792、-0.734、-0.816，P<0.05)，IL-4與Treg無顯著相關性(r=0.356，P>0.05)。

3 討 論

老年MG因其自身運動神經系統功能衰退或合并其他心腦血管或自身免疫性疾病而常導致MG的臨床癥狀不明顯而誤診或漏診，發病早期不易被發現〔4〕。老年MG患者90%可檢測到AChR抗體，高于其他年齡組〔5〕，并存在更高合并胸腺病變的可能性，我國學者研究發現老年MG有26.5%合并胸腺瘤〔6〕。MG是一種自身免疫性疾病，是由T細胞介導，補體參與的產生特異性AChR抗體的免疫失衡狀態下的多系統受累的疾病。其免疫系統狀態的研究是探索疾病形成與發展的重要切入點。DC的功能強大，一方面具有專職抗原呈遞的功能；另一方面誘導初始T細胞成為CD4+T細胞進行重要的特異性免疫功能，與此同時其在免疫耐受與免疫穩態中也發揮重要作用。根據DC的分化成熟程度，成熟DC發揮抗原呈遞功能，其表面高表達主要組織相容性復合體(MHC)分子在內的多種分子可誘導T細胞的活化，發揮特異性免疫效能；而未成熟DC能識別、處理抗原信息，但缺乏共刺激分子不能使之與T細胞表面受體結合，使T細胞趨于免疫耐受狀態〔7〕。

DC在自身免疫性疾病的研究中也逐漸被重視，異常的免疫激活是自身免疫疾病發病的重要環節。系統性紅斑狼瘡(SLE)患者表現出更高比例的活化mDCs，SLE患者的mDC和pDC均表現為與其成熟、功能和信號傳導相關的基因表達的改變，并與血清抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體顯著相關〔8〕。根據DC來源不同，將其區分為mDC與pDC，mDC誘導中間階段輔助性T淋巴細胞(Th0細胞)向Th1細胞方向分化，參與特異性免疫應答；而pDC誘導Th0細胞向Th2細胞方向分化，參與免疫耐受。DC與MG的關系的研究中發現，在MG患者的胸腺組織中發現經典DC(cDC)密度明顯增高，尤其集中于異位生發中心及其周圍，證明MG患者胸腺組織不同部位與不同DC種類含量有差異,在組織及外泌體中均有此發現〔9,10〕。Pei等〔11〕對MG患者外周血DCs進行了定量分析發現DC絕對數量減少，mDC/pDC減低，證明外周血兩種DC組分失衡，機體處于自身免疫反應與免疫耐受之間的失衡狀態。

本研究提示在外周的抗原性刺激發生后，pDC含量的下降導致機體免疫耐受程度降低，機體誘發強有力的免疫應答，AChR抗體含量增加，加速自身免疫疾病的發展。胸腺具有大量免疫細胞和免疫分子，是T淋巴細胞與B淋巴細胞天然發育的重要場所，是人類重要的中樞免疫器官，胸腺與MG關系密切〔12〕，MG患者約有80%合并胸腺異常，其中包括胸腺瘤或胸腺增生等〔13〕。DC是一種胸腺基質細胞，其參與T細胞在胸腺內的分化與選擇。一些研究中發現，pDC會從外周血轉移至其他組織器官中，參與自身免疫病的形成或組織的破壞〔14〕。本研究顯示，在外周血淋巴細胞中的pDC減少，證明胸腺受累后外周組織的免疫平衡遭到破壞，但是胸腺受累的MG患者下降更低的情況可能與機體接受免疫刺激之后，大量pDC從外周血轉移至胸腺組織中，結合其在自分泌大量趨化因子的遷移特性，逐漸成熟過程中參與特異性免疫的應答，并促使MG在胸腺中的破壞，此結果印證了MG患者胸腺中DC含量升高〔9〕與本研究外周血含量下降的特征。

如上述DC誘導強有力的免疫應答的同時，仍發揮誘導免疫耐受的作用。其中pDC可能通過兩種方式參與免疫耐受的形成，一方面通過抑制T細胞的免疫應答減弱過強的免疫反應；另一方面通過誘導Treg生成，發揮其在外周的免疫耐受功能。Treg是CD4+T細胞的一種亞型，其整體的作用是使免疫反應得到抑制與耐受，與慢性感染或腫瘤的形成關系密切〔15〕。本研究所探討的是免疫表型為CD4+CD25+FoxP3+的自然Treg，其特定的表達轉錄因子Foxp3，可以分化為其他類型的Treg。Treg數量及功能上的失調導致T細胞被異常激活而形成的自身免疫性損傷也是許多自身免疫性疾病的重要原因。一些研究表明在MG患者中Treg含量減低，所致進一步的病理損傷〔16〕，本研究也驗證這一觀點。同時，本研究又發現，pDC與Treg在維持MG患者的免疫耐受過程中可能發揮一致性的作用，兩者下降程度呈正相關。正如其他研究發現，DC缺乏小鼠會引起自身免疫的發生，并且DC的減少可以改變外周Treg基因表達譜的改變，DC通過調節Treg功能而保持免疫平衡〔17〕。兩者也被認為與腫瘤免疫逃逸的免疫耐受失衡相關，Hang等〔18〕研究發現在甲狀腺癌患者中Foxp3+Treg數量明顯減低，提示pDCs可誘導初始CD4+T細胞向Foxp3+Treg分化，兩者共同促使腫瘤的免疫逃逸。本研究也發現pDCs與Treg在外周血中同時減低，且具有相關性，可能提示MG患者DC誘導Treg功能減弱，抑制過強的T細胞反應能力減弱，誘發免疫失衡，進一步加重自身免疫抗體對自身的攻擊。

DC細胞在誘導Th細胞向Th1或Th2方向發展時，常分泌相應的細胞因子，IL-12可使Th0細胞向Th1方向發展，并分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子；而IL-4可使Th0細胞向Th2方向發展，并分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子。本研究提示T細胞可能正處于向Th1方向發展的趨勢，存在較強的免疫反應。綜上所述，老年MG患者外周血pDC、Treg減低，可能誘導免疫耐受功能下降，機體處于一個較強的免疫應答狀態，影響疾病的發生和發展。