依托咪酯通過調控LncRNA CDKN2B-AS1/miR-199a-5p表達抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲

姜崇發 王秋紅 劉建 李印玉 馬增瑞 李治松

(1周口市中心醫院麻醉科，河南 周口 466000；2牡丹江心血管病醫院麻醉科；3廣州前海人壽醫院麻醉科；4寧夏回族自治區人民醫院麻醉科；5鄭州大學第一附屬醫院麻醉科)

麻醉藥物可影響腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為，近年來，研究表明麻醉藥物可有效提高膠質瘤治療效果〔1〕。但膠質瘤發病機制尚未完全闡明，而放化療可抑制腫瘤生長，但耐藥性與放射抵抗性可降低治療效果〔2〕。因而探索麻醉藥物對膠質瘤發生發展的作用機制具有重要意義。研究表明依托咪酯可有效治療宮頸癌及其他腫瘤，并可降低老年患者心血管風險〔3,4〕。依托咪酯還可抑制肺腺癌細胞的侵襲和遷移〔5〕。但依托咪酯對膠質瘤細胞增殖、遷移侵襲的影響尚未可知。長鏈非編碼RNA CDKN2B-AS1(LncRNA CDKN2B-AS1)在肝癌中高表達，敲低其表達可抑制肝癌細胞增殖、遷移及侵襲，促進細胞凋亡〔6〕。但關于CDKN2B-AS1對膠質瘤細胞增殖、遷移侵襲的影響尚未可知。starBase預測顯示微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)可能是CDKN2B-AS1的靶基因，研究表明miR-199a-5p在膠質瘤細胞中呈低表達，miR-199a-5p過表達可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲〔7〕。但膠質瘤發生過程中CDKN2B-AS1與miR-199a-5p是否存在靶向調控作用尚未可知。關于依托咪酯是否通過調控CDKN2B-AS1/miR-199a-5p的表達影響膠質瘤細胞的增殖、遷移及侵襲尚未可知。本研究主要探討依托咪酯對膠質瘤細胞惡性生物學行為的影響，初步分析其對CDKN2B-AS1/miR-199a-5p的調控作用機制及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1研究對象 2017年6月至2018年10月于周口布中心醫院就診的膠質瘤患者20例，所有患者經病理證實為腦膠質瘤，其中男11例，女9例，年齡50～70歲，平均(65.27±5.13)歲，腫瘤組織與癌旁組織切除后置于液氮中凍存，術后轉移至-80℃超低溫冰箱保存待測。

1.2材料與試劑 依托咪酯(依托咪酯)購自上海生工生物工程股份有限公司。膠質瘤細胞株U251購自美國ATCC公司。DMEM培養基與胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、結晶紫溶液、蛋白提取試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；二喹啉甲酸(BCA) 蛋白定量檢測試劑盒購自美國Sigma公司；CDKN2B-AS1小干擾RNA(si-CDKN2B-AS1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-199a-5p模擬物(mimics)、陰性對照(miR-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購自上海索寶生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自上海潤成生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自武漢艾美捷科技有限公司；Transwell小室與基質膠均購自美國BD公司；細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1實驗處理與分組 取對數生長期膠質瘤細胞U251，用不同濃度(0.5 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml)的依托咪酯處理，隨機分為Con組(未經任何處理的細胞)、依托咪酯0.5 μg/ml組(含有終濃度為0.5 μg/ml的依托咪酯培養液培養細胞24 h)、依托咪酯1.0 μg/ml組(含有終濃度為1.0 μg/ml的依托咪酯培養液培養細胞24 h)、依托咪酯2.0 μg/ml組(含有終濃度為2.0 μg/ml的依托咪酯培養液培養細胞24 h)〔8〕。采用MTT比色法檢測各組細胞抑制率，選用作用效果最好的依托咪酯劑量組進行后續研究。后續實驗中分別檢測抑制CDKN2B-AS1表達與miR-199a-5p過表達對膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響，實驗分組為si-NC組(細胞中轉染si-NC)、si-CDKN2B-AS1組(細胞中轉染si-CDKN2B-AS1)、miR-NC組(細胞中轉染miR-NC)、miR-199a-5p組(細胞中轉染miR-199a-5p mimics)。為證實依托咪酯可通過調控CDKN2B-AS1/miR-199a-5p軸發揮作用，實驗分組為依托咪酯+pcDNA組(細胞中轉染pcDNA 48 h后使用含有終濃度為40 μmol/L的依托咪酯處理24 h)、依托咪酯+pcDNA-CDKN2B-AS1組(細胞中轉染pcDNA-CDKN2B-AS1 48 h后使用含有終濃度為40 μmol/L的依托咪酯處理24 h)。

1.3.2實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞中CDKN2B-AS1、miR-199a-5p表達水平 采用Trizol法提取各組細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，CDKN2B-AS1正向引物：5'-TGTACTTAACCACTGGACTACCTGCC-3'，反向引物：5'-CATTCTGATTCAACAGCAGAGATCAAAG-3'；GAPDH正向引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；miR-199a-5p正向引物：5'-TCAAGAGCAATAACGAAAAATGT-3'，反向引物：5'-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3'；U6正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。參照試劑盒進行qRT-PCR，其中以cDNA為模板，反應條件：95℃ 2 min(循環1次)，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s(數字和攝氏度中間需要空格)(循環40次)。CDKN2B-AS1以GAPDH為內參，miR-199a-5p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算CDKN2B-AS1、miR-199a-5p相對表達量。

1.3.3MTT比色法檢測細胞增殖 取對數生長期U251細胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入DMEM培養液制備單細胞懸液接種于96孔板(3×104個細胞/孔)，培養24 h，按照“1.3.1”分組處理，每孔加入質量濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，室溫孵育4 h，棄上清，加入DMSO(150 μl/孔)，勻速振蕩10 min充分混勻，應用酶標儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度值(OD)，計算細胞抑制率，細胞抑制率=〔1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)〕×100%。

1.3.4Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 細胞侵襲實驗：培養液預先凍存，用預冷的培養液按照9∶1的比例稀釋基質膠，基質膠稀釋液平鋪于Transwell小室上室的基底面，置于37℃恒溫飽和濕度培養箱內孵育5 h。取對數生長期U251細胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培養液制備單細胞懸液接種于Transwell小室的上室(5×104個細胞/孔)；取600 μl含有10%胎牛血清的培養液置于Transwell小室的下室，放入37℃恒溫飽和濕度培養箱內培養24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶紫染液染色10 min，棉簽擦掉未轉移的細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察侵襲細胞數。細胞遷移實驗：取對數生長期U251細胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培養液制備單細胞懸液接種于Transwell小室的上室(5×104個細胞/孔)，后續實驗步驟同細胞侵襲實驗，培養結束后顯微鏡下隨機選取5個視野觀察遷移細胞數。

1.3.5雙熒光素酶報告基因檢測 starBase預測 CDKN2B-AS1與miR-199a-5p存在結合位點，將結合位點及其突變位點分別插入熒光素酶報告基因載體構建野生型載體WT-CDKN2B-AS1與突變型載體MUT-CDKN2B-AS1，取對數生長期U251細胞，miR-199a-5p mimics分別與WT-CDKN2B-AS1、MUT-CDKN2B-AS1共轉染至U251細胞，miR-NC分別與WT-CDKN2B-AS1、MUT-CDKN2B-AS1共轉染至U251細胞，轉染24 h后收集細胞，檢測細胞熒光素酶活性。

1.3.6Western印跡檢測CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達 收集各組U251細胞，加入蛋白裂解液〔1 ml放射免疫沉淀試驗(RIPA)、1%苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1% 抑肽酶〕提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白上樣量加入十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水中煮10 min蛋白變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳反應條件：80 V 30 min，120 V 90 min(單位之間加空格)，根據marker位置切膠并應用濕轉膜儀將蛋白凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入蛋白一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL，曝光顯影，應用凝膠成像分析系統及ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.4統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析，LSD-t檢驗，Kruska-WallisH檢驗。

2 結 果

2.1LncRNA CDKN2B-AS1和miR-199a-5p在膠質瘤組織中的表達 與癌旁組織相比，膠質瘤組織中CDKN2B-AS1的表達水平顯著升高(P<0.05)，而miR-199a-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 CDKN2B-AS1和miR-199a-5p在膠質瘤組織中的表達

2.2依托咪酯對膠質瘤細胞U251中CDKN2B-AS1和miR-199a-5p表達的影響 與Con組相比，依托咪酯0.5 μg/ml組、依托咪酯1.0 μg/ml組、依托咪酯 2.0 μg/ml組膠質瘤細胞U251中CDKN2B-AS1的表達水平顯著降低(P<0.05)，而miR-199a-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)，不同劑量組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 依托咪酯對膠質瘤細胞U251中CDKN2B-AS1和miR-199a-5p表達的影響

2.3依托咪酯對膠質瘤細胞U251增殖、遷移侵襲的影響 與Con組相比，依托咪酯0.5 μg/ml組、依托咪酯1.0 μg/ml組、依托咪酯 2.0 μg/ml組膠質瘤細胞U251抑制率顯著升高，遷移與侵襲細胞數顯著減少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低，p21蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)，隨著依托咪酯使用劑量的增加而顯著變化(均P<0.05)，其中依托咪酯2.0 μmol/L時膠質瘤細胞U251抑制率顯著高于其他劑量組(P<0.05)，遷移與侵襲細胞數顯著少于其他劑量組(P<0.05)，因而選用依托咪酯2.0 μmol/L進行后續研究，見圖1、表3、圖2。

表3 依托咪酯對膠質瘤細胞U251增殖、遷移侵襲的影響

圖1 膠質瘤細胞U251的遷移侵襲(結晶紫染色，×200)

1～4：Con組、依托咪酯0.5 μg/ml組、依托咪酯1.0 μg/ml組、依托咪酯2.0 μg/ml組圖2 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

2.4抑制CDKN2B-AS1表達對膠質瘤細胞U251增殖、遷移侵襲的影響 與si-NC組相比，si-CD-KN2B-AS1組膠質瘤細胞U251抑制率顯著增加(P<0.05)，遷移與侵襲細胞數顯著減少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而p21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

表4 抑制CDKN2B-AS1表達對膠質瘤細胞U251增殖、遷移侵襲的影響

2.5miR-199a-5p過表達對膠質瘤細胞U251增殖、遷移侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-199a-5p組膠質瘤細胞U251抑制率顯著增加(P<0.05)，遷移與侵襲細胞數顯著減少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而p21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖4、表5。

表5 miR-199a-5p過表達對膠質瘤細胞U251增殖、遷移侵襲的影響

圖4 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

2.6CDKN2B-AS1靶向調控miR-199a-5p的表達 starBase預測顯示CDKN2B-AS1的序列中含有與miR-199a-5p互補的核苷酸序列，見圖5。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，雙熒光素酶報告基因檢測系統結果顯示，miR-199a-5p組MUT-CDKN2B-AS1與miR-NC組比較，熒光素酶活性差異無顯著性；miR-199a-5p組WT-CDKN2B-AS1與miR-NC組比較熒光素酶活性差異顯著(P<0.001)，見表6。qRT-PCR檢測結果顯示，與si-NC組(1.00±0.09)相比，si-CDKN2B-AS1組膠質瘤細胞U251中miR-199a-5p的表達水平顯著升高(2.26±0.23，P<0.05)；與pcDNA組(1.01±0.08)相比，pcDNA-CDKN2B-AS1組膠質瘤細胞U251中miR-199a-5p的表達水平顯著降低(0.39±0.04，P<0.05)。

圖5 CDKN2B-AS1的序列中含有與miR-199a-5p互補的核苷酸序列

表6 雙熒光素酶報告實驗

2.7CDKN2B-AS1過表達逆轉了依托咪酯(2.0 μg/ml)對膠質瘤細胞U251增殖、遷移侵襲的作用 與依托咪酯+pcDNA組相比，依托咪酯+pcDNA-CDKN2B-AS1組膠質瘤細胞U251抑制率顯著降低(P<0.05)，遷移與侵襲細胞數顯著增加(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，p21蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖6、表7。

1～4:Con組，依托咪酯組，依托咪酯+pcDNA組，托托咪酯+pcDNA-CDKN2B-AS1組圖6 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

表7 CDKN2B-AS1過表達逆轉了依托咪酯對膠質瘤細胞U251增殖、遷移侵襲的作用

3 討 論

腦膠質瘤是臨床常見腦部惡性腫瘤之一，根據WHO標準可將腦膠質瘤分為低級別與高級別腦膠質瘤，由于早期診斷準確率較低導致患者錯失最佳治療時機，患者治療后生存期較短〔9〕。因而深入分析影響膠質瘤遷移及侵襲的分子機制具有重要意義。LncRNA在腫瘤發生發展過程中發揮重要調控作用，研究表明其可作為競爭性內源RNA(ceRNA)靶向結合miRNA而間接調控下游靶基因表達從而促進或抑制膠質瘤遷移及侵襲〔10,11〕。

依托咪酯可通過下調(PI3K/Akt)信號通路的活性而抑制垂體瘤細胞的遷移〔12〕。研究報道指出依托咪酯是一種麻醉藥物并可快速通過血腦屏障，研究表明鎮靜類麻醉藥物可抑制多種腫瘤細胞轉移及侵襲從而發揮抗腫瘤作用〔13,14〕。但依托咪酯對腦膠質瘤細胞惡性生物學行為的影響尚未可知。本研究結果說明依托咪酯可降低膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力。研究表明CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白與細胞增殖、遷移與侵襲能力密切相關，其中p21可通過抑制CyclinD1與CDK形成復合物而誘導細胞周期停滯于G0/G1期，抑制細胞增殖，MMP-2、MMP-9屬于MMPs類，其在腫瘤中呈高表達并可增強細胞遷移及侵襲能力〔15,16〕。本研究結果提示依托咪酯可能通過抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達及促進p21表達而減弱膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力。

CDKN2B-AS1可通過靶向miR-411-3p及調控HIF-1a/VEGF/P38途徑而促進卵巢癌發生及發展〔17〕。干擾CDKN2B-AS1的表達可通過上調miR-181a-5p/TGFβI軸從而抑制宮頸癌細胞轉移并促進細胞凋亡〔18〕。本研究結果提示抑制CDKN2B-AS1的表達可降低膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力。通過雙熒光素酶報告實驗證實CDKN2B-AS1可負向調控miR-199a-5p的活性，研究表明miR-199a-5p可通過下調ERK5的表達而抑制乳腺癌細胞侵襲〔19〕。Zhou等〔20〕研究表明miR-199a-5p通過靶向CCR7抑制膀胱癌細胞轉移。與上述研究報道相似，本研究結果顯示miR-199a-5p在膠質瘤組織中表達水平降低，miR-199a-5p過表達后可顯著抑制膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲。本研究結果提示依托咪酯可通過下調CDKN2B-AS1的表達及上調miR-199a-5p的表達而抑制膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲。

綜上，依托咪酯可抑制膠質瘤生長及轉移，其作用機制主要是通過調控CDKN2B-AS1/miR-199a-5p的表達從而發揮作用，為臨床合理用藥及研發藥物提供新方向，可為深入探討吩噻嗪類藥物對腫瘤的作用機制提供研究依據。