MEBO對糖尿病大鼠創面自噬信號因子Beclin1、LC3、p62的調控作用

麻華膽 黃慶 鄭愛甜 劉賢彬 李政 王琳 曾娜 吳標良

(右江民族醫學院 1附屬醫院內分泌科，廣西 百色 533000；2研究生學院)

糖尿病潰瘍創面是糖尿病的常見并發癥，主要發生于血糖控制不良患者，代謝紊亂導致潰瘍創面愈合不良，在治療上顯得尤為棘手。濕潤燒傷膏(MEBO)是一種中藥制劑，富含β-谷甾醇、黃芩甙、小檗堿等藥理成分及亞油酸、氨基酸、糖類等營養成分，具有改善循環、抗炎抑菌、化癥止痛之功效并為細胞的增殖再生提供能量。實踐表明，MEBO可促進糖尿病潰瘍創面的愈合，然而，其作用機制尚未完全明了。自噬作為一種自我保護機制，在維持細胞存活、更新、物質循環和組織穩態方面起重要作用。研究顯示，細胞自噬在創面愈合過程中的炎癥反應、肉芽組織形成、再上皮化、創面重建等多環節均發揮重要作用〔1〕。本文擬分析MEBT/MEBO對糖尿病大鼠潰瘍創面Beclin1、LC3、p62表達的影響及其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠250只，3月齡，體重230～260 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供。本實驗經右江民族醫學院動物倫理委員會批準。

1.2主要試劑 康復新液：湖南科倫制藥有限公司生產；MEBO：汕頭市美寶制藥有限公司生產；Beclin1、p-Beclin1、LC3A/B、p62抗體：Abcam公司生產；山羊抗兔Ig(100 μl)、β-actin抗體(100 μl)：北京中杉金橋生物技術有限公司生產；Beclin1、LC3、p62、β-actin引物：上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3創面模型的建立及創面處理方法 大鼠予適應性喂養1 w后分組。空白組只做備皮處理，對照組在背部建立常規創面模型，模型組、康復新組、MEBO組予腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ)誘導糖尿病大鼠模型后行全層皮膚切除〔2〕。創面模型建立后予每日換藥2次，對照組、模型組予以生理鹽水紗布外敷，康復新組、MEBO組分別外敷康復新及MEBO紗布。各組于第1、5、11、18、25天各隨機取10只大鼠，采集創面組織后處死。將采集到的樣本分別用于制作蘇木素-伊紅(HE)染色切片、免疫熒光染色切片、透射電鏡超薄切片及行qRT-PCR和Western印跡檢測。

1.4記錄創面面積并計算創面愈合率 分別于上述5個時相點，將刻度尺作為參照，對創面進行拍照，采用Image J軟件測定未愈合創面的面積并計算愈合率，創面愈合率=(原始的創面面積-未愈合的創面面積)/原始的創面面積×100%。

1.5HE染色觀察病理改變 予10%甲醛固定組織樣本，48 h后依次脫水、透明、浸蠟包埋、切片、烤片、HE染色制片，光學顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤、肉芽組織生長及再上皮化情況。

1.6組織切片觀察Beclin1、LC3、p62免疫熒光染色 組織切片脫蠟水化后依次進行抗原修復、封閉、一抗孵育、二抗孵育、染色、封片，熒光顯微鏡下觀察熒光細胞染色情況，每張切片隨機選取3個視野(×400)，用Image J測定其OD值。

1.7電鏡觀察細胞內自噬體 組織樣本予戊二醛溶液4℃固定，再予1%鋨酸固定、梯度脫水、組織浸透、樹脂包埋，電鏡下觀察自噬體數目、形態及結構，每張切片隨機選取3個細胞，每個細胞選取1個典型視野(×8 000)，統計每個視野的自噬體，取其平均值進行對比。

1.8Western印跡檢測Beclin1、p-Beclin1、LC3、p62的表達水平 按照Western印跡操作規程依次提取總蛋白，測定總蛋白質濃度并計算蛋白上樣量。制作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、加樣、電泳、轉膜、封閉后4℃孵育一抗過夜，翌日孵育二抗后顯影。

1.9qRT-PCR分析Beclin1、LC3、p62mRNA的表達 液氮研磨待檢組織，提取總RNA，測定總RNA濃度及質量。將測定合格的總RNA進行反轉錄，然后以cDNA為模板，進行PCR擴增。

1.10統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1創面愈合情況 治療第5天，對照組創面輕微水腫，粉紅色肉芽組織均勻分布，模型組、康復新組、MEBO組創面晦暗、水腫明顯，表面痂皮覆蓋，撕痂后可見少許肉芽組織形成。治療第11天，各組創面紅潤，可見大片鮮紅色肉芽組織形成，肉芽組織長勢相當。治療第18天，對照組創面基本愈合，僅留一點狀疤痕；康復新組、MEBO組、模型組創面干燥，康復新組、MEBO組創面大部分上皮化，肉芽組織不明顯，模型組仍可見顆粒狀肉芽組織生長。治療第25天，對照組、康復新組、MEBO組創面均已愈合，模型組創面接近愈合，見圖1。

圖1 4組治療后不同時間點創面愈合情況

2.2創面愈合率 第5天，各組創面愈合率大致相當(P>0.05);第11天，模型組創面愈合率顯著低于對照組、康復新組、MEBO組(P<0.05)，對照組與康復新組、康復新組與MEBO組比較差異均無統計學意義(P>0.05)；第18天，對照組>MEBO組>康復新組>模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；第25天，對照組、康復新組、MEBO組創面愈合率相當(P>0.05)，模型組顯著低于對照組、康復新組、MEBO組(P<0.05)，見表1。

表1 4組治療不同時間點創面愈合率比較

2.3創面組織病理形態學 治療第5天，對照組、模型組、康復新組、MEBO組創面組織大量炎癥細胞浸潤，少許成纖維細胞及毛細血管形成，其中模型組水腫及炎性浸潤最為明顯。第11天，各組炎癥細胞浸潤均較前減輕，大量肉芽組織形成，仍以模型組的炎癥細胞浸潤最為明顯，而成纖維細胞及毛細血管分布較對照組、康復新組、MEBO組稀疏紊亂。第18天，對照組可觀察到完整表皮及皮膚附屬器，康復新組、MEBO組毛細血管部分萎縮，成纖維細胞致密排列，模型組尚可見較為明顯的毛細血管網，成纖維細胞排列仍較為紊亂。第25天，各組可見結構完整的皮脂腺、毛囊，組織表面表皮覆蓋，見圖2。

圖2 4組治療后不同時間點創面組織(HE染色，×100)

2.4Beclin1、LC3、p62免疫熒光染色結果 空白組各時相點及各組第1天創面組織內均觀察到少量Beclin1、LC3陽性染色細胞；第5天起，創面模型各組可見大量陽染細胞，早期陽染細胞數明顯多于晚期。熒光強度分析亦顯示各組第5、11天OD值高于第18、25天，治療第5天MEBO組OD值高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)。p62陽性染色細胞在空白組及各組第1天創面組織中高度表達，第5天各組陽染細胞明顯減少，此后，可見陽染細胞數回升，熒光強度分析顯示各組第5、11天OD值低于第18、25天，治療第5天MEBO組OD值低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3～5、表2～4。

表2 5組治療后不同時間點創面組織內Beclin1 OD值比較

表3 5組治療后不同時間點創面組織內LC3 OD值比較

表4 5組治療后不同時間點創面組織內p62 OD值比較

圖3 5組創面組織Beclin1表達(免疫熒光，×400)

圖4 5組創面組織治療后不同時間點LC3表達(免疫熒光染色，×400)

圖5 5組治療后不同時間點創面組織P62表達(免疫熒光染色，×400)

2.5創面組織自噬體檢測結果 第1天，創面模型各組組織細胞內可見少量自噬體，第5天可觀察到成纖維細胞內多個雙層或多層膜結構的自噬體，部分自噬體內可見殘留細胞器，其中以模型組細胞內自噬體數最少，隨后各個時相點，各組自噬體數目逐漸減少，見表5、圖6。

表5 各組治療后不同時間點創面組織細胞內自噬體數量比較

2.6Beclin1、p-Beclin1、LC3、p62蛋白檢測結果 除空白組以外，各組Beclin1、p-Beclin1的表達量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升后下降，對照組、康復新組、MEBO組于第5天表達最高，隨后逐漸降低，模型組第5天或第11天的表達量最高，表達峰值延遲，治療早期，MEBO組的表達量高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。p62的表達量下降后上升，各組第5天的表達量最低，對照組、康復新組、MEBO組于第5天達到最低值后隨即逐漸升高，模型組表達量回升延遲。治療早期，MEBO組的表達量低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖7、表6～9。

D1、D5、D11、D18、D25：第1天、第5天、第11天、第18天、第25天圖7 5組治療后不同時間點創面組織Beclin1、p-Beclin1、LC3、p62蛋白表達條帶

表6 5組治療后不同時間點創面組織內Beclin1蛋白表達水平比較

表7 5組治療后不同時間點創面組織內p-Beclin1蛋白表達水平比較

表8 5組治療后不同時間點創面組織內LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值比較

表9 5組治療后不同時間點創面組織內p62蛋白表達水平比較

2.7Beclin1、LC3、p62 mRNA檢測結果 除空白組以外，Beclin1、LC3 mRNA的表達上升后下降，各組于第5天的表達量最高，對照組、康復新組、MEBO組表達量達峰值后隨即逐漸降低，模型組表達峰值延遲，于第11天表達量最高，治療早期，MEBO組第5天表達量高于模型組(P<0.05)。p62 mRNA的表達先下降后上升，各組于第5天的表達量最低，對照組、康復新組、MEBO表達量達最低值后隨即逐漸升高，模型組表達量回升延遲，治療早期，MEBO組的表達量低于模型組(P<0.05)。見表10～12。

表10 5組治療后不同時間點創面組織內Beclin1 mRNA表達水平比較

表11 5組治療后不同時間點創面組織內LC3 mRNA表達水平比較

表12 5組治療后不同時間點創面組織內p62 mRNA表達水平比較

3 討 論

細胞自噬是真核生物進化過程中高度保守的降解系統，參與細胞的新陳代謝并維持細胞結構和功能穩定。Beclin1與自噬前體的形成有關，饑餓狀態下，活化的ULK1將Beclin1的Ser 14位點磷酸化，從而提高Vps34復合體的活性，Vps34是哺乳動物中唯一的Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶(PI3K-Ⅲ)，催化磷脂酰肌醇(PI)磷酸化生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)，PI3P在內質網膜局部聚集并招募自噬相關蛋白從而促進自噬前體的形成〔3〕。LC3是一種自噬體膜相關蛋白，在自噬流中以LC3Ⅰ、LC3Ⅱ兩種形式存在，LC3Ⅰ在Agt7和Agt3的作用下，與磷酯酰乙醇胺(PE)結合后形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ黏附于自噬體膜上，參與自噬膜的形成與延伸，同時，LC3Ⅱ與p62蛋白LC3識別序列(LRS)結構域結合后形成選擇性自噬受體，介導泛素化蛋白的聚集〔4〕。p62是連接泛素-蛋白酶體系統(UPS)和自噬途徑的受體蛋白，選擇性與泛素化蛋白結合并轉運至自噬體，之后自身隨泛素化蛋白一起通過自噬途徑降解〔5〕。因此，p62的蛋白水平與選擇性自噬的活性呈負相關。

本研究結果表明糖尿病狀態抑制創面的愈合并降低自噬水平。這與前期的研究結論一致，高糖環境〔6〕、胰島素抵抗〔7〕、糖基化終產物的堆積〔8〕、免疫功能紊亂〔9〕等均與創面愈合不良相關。長期高糖暴露下，自噬相關蛋白的合成障礙〔10〕及線粒體、溶酶體功能損害，致自噬溶酶體生成障礙〔11〕是自噬抑制的主要原因。本研究結果還表明MEBO可有效促進創面愈合。生長因子和P物質的高表達〔12〕及增強表皮干細胞的活化、增殖〔13〕被認為是其主要作用機制。本文結果提示自噬水平的提高可能為MEBO促進創面愈合的機制之一。在創面形成初期，細胞處于高度的應激狀態，加之新生血管尚未形成，創面組織缺血缺氧，細胞處于饑餓狀態，mTORC1受抑制，引起ULK1的活化，活化的ULK1將Beclin1磷酸化，從而促進自噬前體的形成。LC3在自噬啟動后加強蛋白剪切及泛素樣反應，形成大量LC3Ⅱ，參與自噬前體的延伸及協助泛素化蛋白進入自噬溶酶體，因此，創面愈合早期Beclin1的磷酸化水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高。p62作為選擇性自噬的介導分子，其在創面愈合早期的低表達表明選擇性自噬在此時處于活躍狀態。自噬在創面愈合早期發揮重要作用〔1〕，一是活化中性粒細胞、提高巨噬細胞的吞噬能力并向M2轉化，在增強固有免疫的同時及時啟動組織修復；二是促進間充質干細胞的增殖和分化。啟動創面修復后，自噬的激活有助于成纖維細胞的增殖與分化及角質形成細胞的遷移，加速新生血管形成。創面愈合晚期，自噬水平回落，可能為創面組織細胞的饑餓狀態改善，對mTORC的抑制作用減弱，從而使Beclin1的磷酸化水平及LC3轉化率逐漸降低，p62逐漸升高。關于模型組Beclin1、p-Beclin1的表達量及LC3轉化率高峰延遲或后移的實驗結果，推測在缺乏有效藥物干預的情況下，模型組自噬水平在治療早期偏低，致愈合效率低下，乃至治療晚期，創面缺血缺氧仍未顯著改善，對自噬的刺激作用未明顯減弱，使得模型組Beclin1、p-Beclin1的表達量及LC3轉化率在治療晚期仍保持較高水平，這也是第25天模型組Beclin1、p-Beclin1的表達量及LC3轉化率普遍高于康復新組和MEBO組的原因所在。在創面重建過程中，自噬的抑制可促進成纖維細胞的凋亡及減少膠原合成〔14〕，以減少瘢痕形成，因此，創面愈合晚期自噬水平的低下也可能與機體基于防止瘢痕形成而作出的適應性自噬下調有關。

綜上，MEBO可有效促進糖尿病創面的愈合，對細胞自噬的調控可能為其作用機制之一。藥物阻斷溶酶體降解后再測定LC3Ⅱ的水平更能體現自噬的改變，但由于實驗設計有限，未能在藥物干預的條件下測定，有待進一步驗證。