干擾LINC00707對食管癌細胞生物行為的影響

吳云飛 張智慧 陳旭源 梁鴻章 李軍 劉南波 吳旭

(1西南醫科大學附屬醫院胸外科，四川 瀘州 646000；2南方醫科大學南方醫院胸外科；3喀什地區第一人民醫院胸外科；4南方醫科大學第三附屬醫院胸外科；5 廣東省人民醫院胸外科；6南方醫科大學南方醫院胸外科/惠僑醫療中心)

食管癌是我國高發病率、高死亡率的惡性腫瘤之一，早期可通過手術或手術為主的綜合治療；而晚期食管癌缺乏有效治療手段，靶向治療是食管癌的一種新治療手段〔1,2〕。研究表明lncRNA可預測多種惡性腫瘤的發生或預后，并可成為一類新的腫瘤標志物及潛在的治療靶標〔3〕。長的基因間非編碼RNA00707(LINC00707)是一種lncRNA，研究報道LINC00707在胃癌和肺腺癌組織中均過表達，且與胃癌、肺腺癌患者的晚期、腫瘤較大、淋巴結轉移和預后較差有關；LINC00707促進了胃癌、肺腺癌細胞的增殖和轉移〔4，5〕。敲低LINC00707可顯著降低肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡〔6〕。LINC00707通過miR-206/FMNL2軸促進大腸癌的細胞增殖和侵襲〔7〕，表明LINC00707不僅影響患者預后，還參與調控多種腫瘤細胞的惡性生物學行為，然而LINC00707對食管癌細胞惡性生物學行為的影響及機制尚不清楚。研究報道癌癥相關的成纖維細胞源性miR-382-5p促進口腔鱗狀細胞癌的遷移和侵襲〔8〕。miR-382-5p可能通過靶向癌基因YBX1來抑制神經膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲〔9〕。生物學在線軟件預測發現LINC00707與miR-382-5p有結合位點。而LINC00707與miR-382-5p是否有靶向關系尚未可知。本實驗旨在研究LINC00707對食管癌細胞惡性生物學行為的影響及機制。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取西南醫科大學附屬醫院2017年1月至2020年12月51例食管癌患者，通過手術取其癌組織及癌旁正常組織(離癌組織邊緣2 cm)，所有患者經病理檢測確診為食管癌，術前未進行過放化療，所有患者知情且同意。

1.2主要試劑 食管癌細胞EC9706(美國ATCC)；RPMI1640培養基(美國Gibco)；Trizol試劑(美國GENMED)；逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本Takara)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法試劑盒、凋亡檢測試劑盒(日本同仁研究所)；蛋白提取試劑盒(北京百奧萊博)；Bax、Bcl-2和GAPDH抗體(美國Abbiotec)；山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)(美國GeneCopoeia)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國AAT Bioquest)。

1.3細胞轉染與分組 食管癌細胞EC9706用RPMI1640培養基培養，取對數生長期細胞，將LINC00707干擾載體質粒及陰性對照、miR-382-5p模擬物、抑制劑及其陰性對照分別轉染至EC9706細胞，記為si-LINC00707組、si-NC組、miR-382-5p組、miR-NC組、anti-miR-382-5p組、anti-miR-NC組；將LINC00707干擾載體質粒與miR-382-5p抑制劑共轉染至EC9706細胞，記為si-LINC00707+anti-miR-382-5p組；正常培養的細胞作為對照(con)組。

1.4實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測LINC00-707和miR-382-5p的表達水平 提取食管癌組織、癌旁組織及各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。以GAPDH和U6為內參，LINC00707上游引物序列：5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3'，下游引物序列：5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGGCCCGAAACCTCTACTG-3'，下游引物序列：5'-GCACACTCGATTTTAGGGTTCT-3'；miR-382-5p上游引物序列：5'-ATCCGTGAAGTTGTTCGTGG-3'，下游引物序列：5'-TATGGTTGTAGAGGACTCCTTGAC-3'；U6上游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，下游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'。

1.5MTT比色法檢測細胞增殖活性 各組細胞培養24、48、72 h時，每孔分別加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，于培養箱中繼續孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩反應10 min使沉淀溶解，用酶標儀于波長490 nm處檢測吸光度(OD)值。

1.6克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數 將各組細胞消化后加入細胞培養液重懸，以每孔100個細胞接種于6孔板中，培養2 w左右，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，然后用甲醇固定細胞，再加入吉姆薩染色液，染色30 min，最后在顯微鏡下計數大于50個細胞的集落。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡率 用不含乙二胺四乙酶(EDTA)的胰酶消化各組細胞，離心收集，用預冷的PBS洗滌細胞；加入300 μl結合緩沖液，加入5 μl Annexin V-FITC和PI，混勻、避光室溫孵育15 min；上機前補加 200 μl結合緩沖液，上流式細胞儀檢測。

1.8劃痕實驗檢測細胞遷移距離 各組細胞消化后接種在培養板，待細胞生長至鋪滿培養板后，用槍頭在板中間直線劃痕，用PBS沖洗劃下的多余細胞，換液后繼續培養，在培養0和24 h拍照觀察，計算遷移距離。

1.9Western印跡檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，以40 μg/孔上樣蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后轉膜，再進行封閉1 h，洗膜后分別加入Bax、Bcl-2和GAPDH抗體(1∶800)，4℃孵育過夜；洗膜后加入HRP標記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h；電化學發光(ECL)顯色，顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白的相對表達量。

1.10雙熒光素酶報告實驗 構建LINC00707的野生型和突變型熒光素酶載體，將其分別與miR-NC和miR-382-5p共轉染至EC9706細胞中，按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.11統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析及Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1LINC00707和miR-382-5p在食管癌組織和各處理組細胞中的表達 與癌旁正常組織(0.98±0.13、0.99±0.11)相比，食管癌組織中LINC00707表達水平(3.84±0.35)顯著升高，miR-382-5p表達水平(0.33±0.04)顯著降低(P<0.05)；LINC00707和miR-382-5p表達水平呈負相關(圖1)。與con組(1.00±0.01、1.00±0.00)和si-NC組(0.99±0.03、1.00±0.01)相比，si-LINC00707組LINC00707表達水平(0.23±0.03)顯著降低，miR-382-5p表達水平(3.81±0.12)顯著升高(P<0.05)；與miR-NC組(1.00±0.02)相比，miR-382-5p組miR-382-5p表達水平(4.38±0.15)顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-NC組(1.01±0.01)相比，anti-miR-382-5p組miR-382-5p表達水平(0.14±0.01)顯著降低(P<0.05)；與si-LINC00707組相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p組miR-382-5p表達水平(1.25±0.08)顯著降低(P<0.05)。

圖1 LINC00707和miR-382-5p負相關

2.2各處理組對EC9706細胞活性和克隆形成的影響 與con組和si-NC組相比，si-LINC00707組EC9706細胞活性降低，克隆形成數顯著減少(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-382-5p組EC9706細胞活性顯著降低，克隆形成數顯著減少(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-382-5p組EC9706細胞活性升高，克隆形成數增加(P<0.05)；與si-LINC00707組相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p組EC9706細胞活性升高，克隆形成數增加(P<0.05)，見表1。

表1 克隆形成實驗檢測各處理組EC9706中克隆形成數

2.3各處理組對EC9706凋亡的影響 與con組和si-NC組相比，si-LINC00707組EC9706細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-382-5p組EC9706細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-382-5p組EC9706細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與si-LINC00707組相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p組EC9706細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖2，表2。

圖2 各個處理組對細胞凋亡率的影響

2.4各處理組對EC9706遷移的影響 與con組和si-NC組相比，si-LINC00707組EC9706細胞遷移距離顯著縮短(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-382-5p組EC9706細胞遷移距離顯著縮短(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-382-5p組EC9706細胞遷移距離顯著增大(P<0.05)；與si-LINC00707組相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p組EC9706細胞遷移距離顯著增大(P<0.05)，見表2。

表2 流式細胞儀檢測各處理組EC9706凋亡率

2.5各處理組對EC9706中凋亡蛋白表達的影響 與con組和si-NC組相比，si-LINC00707組EC9706細胞中Bax表達水平顯著升高，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-382-5p組EC9706細胞中Bax表達水平顯著升高，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-382-5p組EC9706細胞中Bax表達水平顯著降低，Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)；與si-LINC00707組相比，si-LINC00707+anti-miR-382-5p組EC9706細胞中Bax表達水平顯著降低，Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖3，表3。

1～8：con組、si-NC組、si-LINC00707組、miR-NC組、miR-382-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-382-5p組、si-LINC00707+anti-miR-382-5p組圖3 各處理組細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達的檢測

表3 Western印跡檢測各處理組EC9706中Bax和Bcl-2蛋白表達

2.6雙熒光素酶報告實驗檢測LINC00707和miR-382-5p靶向關系 LINC00707和miR-382-5p互補序列見圖4；WT-LINC00707與miR-382-5p共轉染的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而MUT-LINC00707與miR-382-5p共轉染的細胞熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)，見表4。

圖4 LINC00707和miR-382-5p互補序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

3 討 論

食管癌是最常見的胃腸道惡性疾病之一，其發病率相對較高，且逐年增加。因此，對食管癌致癌作用的分子機制研究及新的生物標志物和治療靶標的確定對于目前食管癌的治療非常有益〔10,11〕。而非編碼RNA可作為食管癌預后因素和治療靶點〔12〕。研究報道LINC00707的沉默減弱了透明細胞腎細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力〔13〕。敲低LINC00707通過miR-30c/CTHRC1抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖，侵襲和遷移〔14〕。敲低LINC00707可通過與miR-485-5p結合來抑制結直腸癌細胞的增殖〔15〕。本實驗結果提示LINC00707可能在食管癌中起促癌作用。干擾LINC00707表達后，EC9706細胞活性降低，克隆形成數減少，細胞凋亡率升高，細胞遷移距離縮短，Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低；表明干擾LINC00707可抑制食管癌EC9706細胞增殖、克隆形成及遷移，并促進細胞凋亡。

研究報道miR-382-5p通過靶向抑制NF90抑制乳腺癌細胞的增殖，促進細胞的凋亡〔16〕。本實驗結果表明過表達miR-382-5p可抑制食管癌EC9706細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡。而抑制miR-382-5p表達與過表達miR-382-5p的作用相反。研究報道LINC00265通過靶向miR-382-5p介導SAT1和VAV3來促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移、侵襲〔17〕。lncRNA SNHG14通過使miR-382-5p海綿化來調節SPIN1表達以促進非小細胞肺癌進展〔18〕。表明lncRNA可調控miR-382-5p影響腫瘤進展。本實驗結果提示，LINC00707可能通過調控miR-382-5p影響食管癌細胞進展。

綜上，干擾LINC00707可能通過上調miR-382-5p抑制食管癌細胞的惡性生物學行為。