基于自噬與凋亡平衡探討補腎活血湯對衰老耳蝸毛細胞株HEI-OC1的保護作用

郭向東 王青玲 張夢嫻 王慶林

(1河南中醫藥大學第一附屬醫院耳鼻喉科，河南 鄭州 450000;2河南中醫藥大學;3河南醫學高等專科學校)

老年性耳聾(AHL)是老年人最常見的一種感覺障礙，中醫學認為其屬于“耳鳴、耳聾”等范疇，腎虛血瘀是其主要病機，“補腎活血、化瘀開竅”是針對AHL的主要治療方法〔1〕。研究發現〔2〕，補腎活血湯在AHL的臨床治療中應用廣泛且療效顯著，但其具體作用靶點尚不清楚，仍需進一步探討。耳蝸毛細胞自噬減弱及凋亡增強是AHL的主要發病機制之一〔3，4〕，但目前從自噬和凋亡水平探討衰老狀態下的體外耳蝸毛細胞生物學功能的研究甚少。未見有研究補腎活血湯對衰老耳蝸毛細胞株HEI-OC1細胞的保護作用。中藥能否通過調控自噬對衰老所致的耳蝸神經細胞損傷發揮保護作用，目前鮮有報道。本研究為排除在體各因素的影響，體外培養小鼠耳蝸來源的耳蝸毛細胞株HEI-OC1，利用D-半乳糖(D-gal)誘導構建衰老細胞模型，研究補腎活血湯對衰老HEI-OC1細胞生物學功能的影響，并探討補腎活血湯調控衰老耳蝸毛細胞株HEI-OC1自噬和凋亡平衡的相關機制。

1 材料與方法

1.1細胞株HEI-OC1 由美國豪斯耳研所(House Ear Institue，USA)Fedrico Kalinec教授惠贈。

1.2實驗 動物4周齡SPF級健康SD大鼠40只，雌雄各半，體重(150±20)g〔南京大學動物模式中心，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008〕。于SPF級環境中飼養，室內溫度控制在(23±2)℃，自由飲食和攝水，實驗前適應性飼養3 d。

1.3實驗藥物補腎活血湯配方顆粒(熟地黃18 g、菟絲子18 g、杜仲6 g、肉蓯蓉6 g、枸杞子6 g、補骨脂18 g、山萸肉6 g、獨活6 g、當歸6 g、紅花3 g、沒藥6 g)，購自四川新綠色藥業科技發展有限公司。

1.4試劑與儀器 D-gal(Sigma，美國，批號：G5388)、胎牛血清(FBS,Gibco，美國，批號：10099133C)；DMEM(高糖)培養基(Gibco，美國，批號：11995040)；胰蛋白酶(Gibco，美國，批號：25200056)；噻唑藍(MTT)試劑盒(碧云天，中國，批號：C0009S)；β-半乳糖苷酶染色試劑盒(S0033)(碧云天，中國，批號：C0602)；膜聯蛋白V/碘化丙啶(AnnexinV/PI)雙染試劑盒(Invitrogen，美國，批號：v13241)；抗Atg5、抗Atg12、抗Beclin1、抗p62 抗體( Cell Signaling Technology，美國，批號：12994、4180、3495、23214)；抗B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)、Bcl-2抗體(Abcam，英國，批號：ab32503、ab182858)；Forma 3111型水套式CO2培養箱(美國Thermo)；BD LSR Fortessa流式細胞分析儀(美國BD)；凝膠成像系統(美國 Bio-Rad)；Tanon 6600發光成像工作站(上海天能)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.5制備補腎活血湯含藥血清 SD大鼠隨機分組，補腎活血湯含藥血清組30只，空白血清(對照)組10只。按臨床體表面積換算，含藥血清組以補腎活血湯生藥7.41 g/(kg·d)灌胃(臨床等效劑量)、2次/d，連續7 d；對照組給予等體積蒸餾水灌胃。于末次給藥后1 h，無菌條件下腹主動脈插管取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清。56℃滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌、分裝，-20℃冰箱保存備用。用DMEM 培養基稀釋成低、中及高劑量組(5%、10%、20%)的補腎活血湯含藥血清備用。

1.6細胞培養與實驗分組 HEI-OC1細胞置于含有10%FBS的DMEM(高糖)培養基，33℃，10%CO2飽和濕度培養箱中培養，觀察細胞密度為 80%～90%后傳代，24 h后用新鮮完全培養液替換培養液，待細胞進入對數生長期即可用于實驗。實驗設對照組、衰老組、補腎活血湯低、中、高劑量組，各組均設6個復孔。對照組細胞在培養24 h后每隔12 h換液1次，衰老組直接加入20 mg/ml的D-gal處理 24 h，補腎活血湯低、中、高劑量組分別加入5%、10%、20%的補腎活血湯含藥血清培養4 h，再加入D-gal 20 mg/ml繼續培養24 h。

1.7MTT比色法檢測細胞的增殖能力 將各組細胞按5 000個接種于96孔板，置于33℃，10%CO2條件下培養。在0和24 h，每孔加5 g/L的MTT 20 μl，33℃，10%CO2條件下培養4 h，孵育結束后，棄去各孔上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，細胞振蕩儀上振蕩10 min，待結晶物充分溶解后用酶標儀測定OD570。每組取12個孔的OD570平均值。以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.8β-半乳糖苷酶染色檢測細胞的衰老狀態 先用普通光學顯微鏡拍照(200×)，再吸出細胞培養液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸出細胞固定液，用PBS洗滌細胞3次，3 min/次。吸出PBS，每孔加入1 ml染色工作液(β-半乳糖苷酶染色液A：10 μl，β-半乳糖苷酶染色液B：10 μl，β-半乳糖苷酶染色液C：930 μl，x-Gal溶液：50 μl)，37℃孵育過夜。普通光學顯微鏡下觀察拍照(200×)。

1.9Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測檢測細胞凋亡 準備適量的1×的Annexin結合液和100 μg/ml的PI工作液。收集各組細胞用4℃預冷的PBS清洗，4℃，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入1×的Annexin結合液重懸，調整細胞密度至1×106/ml。加入5 μl Alexa Fluor?488 annexin V和1 μl 100 μg/ml PI工作液到每100 μl的細胞懸液中，室溫孵育細胞15 min，補充Annexin結合液400 μl，采用流式技術檢測1×104個細胞。利用 Cell Quest 軟件進行分析，計算細胞凋亡率。

1.10Western印跡檢測細胞中自噬與凋亡蛋白的表達 將各組細胞以密度為8×104/孔接種于96孔板中，次日細胞貼壁后棄去上清培養液加入含有不同化合物的培養基，24 h后收集細胞并用 PBS洗一次，加入放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液提取總蛋白。使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度并調整其濃度后加上樣緩沖液煮沸10 min致蛋白變性。使用十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品蛋白后，濕轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后封閉，用 5%脫脂奶封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的Atg5、Atg12、Beclin1、p62、Bax、Bcl-2和GAPDH一抗，于4℃孵育過夜。將膜與辣根過氧化物酶(HRP)耦聯的二抗(1∶1 000)孵育50 min。通過增強化學發光法檢測印跡中的陽性條帶，以GAPDH為內參分析各蛋白相對表達水平。

1.11統計學處理 采用Graph Pad Prism8.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1補腎活血湯對HEI-OC1細胞增殖的影響 HEI-OC1細胞經不同濃度的補腎活血湯含藥血清處理24 h后，與對照組相比，衰老組細胞活力顯著下降(P<0.05)；與衰老組相比，補腎活血湯各濃度組細胞活力顯著升高，并具有濃度依賴性，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組HEI-OC1細胞不同時間OD570吸光度值

2.2補腎活血湯對HEI-OC1細胞衰老的影響 對照組中有少量衰老細胞；D-gal處理后的HEI-OC1細胞可見大量β-半乳糖苷酶染色細胞陽性細胞(藍染細胞)，與對照組相比，衰老組β-半乳糖苷酶陽性細胞數量明顯增加，陽性染色率〔(60.86±7.61)%〕明顯高于對照組〔(11.31±2.53)%〕(P<0.01)；與衰老組相比，補腎活血湯各組β-半乳糖苷酶陽性細胞數量明顯減少，陽性染色率〔低、中、高濃度組分別為(38.38±4.92)%、(20.18±3.15)%、(13.85±2.33)%〕明顯降低(P<0.01),具有濃度依賴性，提示D-gal能誘導HEI-OC1細胞衰老，而補腎活血湯可減輕細胞衰老，見圖1。

圖1 各組HEI-OC1細胞光鏡形態和β-半乳糖苷酶染色后的陽性細胞(×200)

2.3補腎活血湯對HEI-OC1細胞凋亡的影響 衰老組HEI-OC1細胞的凋亡率〔(28.03±4.57)%〕明顯高于對照組〔(5.44±1.63)%；P<0.05〕，與衰老組相比，補腎活血湯低、中、高劑量組的凋亡率〔(17.81±3.24)%、(12.06±2.96)%、(7.73±1.31)%〕顯著降低(P<0.05)。提示補腎活血湯可通過降低細胞凋亡而減輕D-gal引起的HEI-OC1細胞衰老，見圖2。

圖2 各組HEI-OC1細胞雙變量流式細胞儀散點圖

2.4Western印跡分析補腎活血湯對HEI-OC1細胞自噬與凋亡相關蛋白的影響 與對照組相比，衰老組 Atg5、Atg12和 Beclin1蛋白表達水平顯著下降，p62蛋白表達水平顯著上升(P<0.01)；與衰老組相比，補腎活血湯各組 Atg5、Atg12和 Beclin1 蛋白表達水平顯著上升，p62 蛋白表達水平顯著下降(P<0.05；P<0.01)。提示補腎活血湯可通過激活自噬減輕D-半乳糖導致的HEI-OC1細胞衰老。與對照組相比，衰老組Bax蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2 蛋白表達水平顯著下降(P<0.01)，與衰老組相比，補腎活血湯各組Bax蛋白表達水平顯著下降，Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高(P<0.05；P<0.01)。提示補腎活血湯可抑制凋亡減輕D-gal能引起的HEI-OC1細胞衰老，見表2、圖3。

表2 各組HEI-OC1細胞中自噬及凋亡相關蛋白的表達

1～5：對照組、衰老組、5%補腎活血湯組、10%補腎活血湯組、20%補腎活血湯組圖3 各組HEI-OC1細胞中自噬、凋亡相關蛋白表達

3 討 論

65～75歲人群中AHL的發病率高達70%～80%〔5〕。目前AHL的發病機制尚不明確，治療手段極其有限，因此，研究AHL的發病機制并尋求有效治療的藥物是目前亟待解決的問題。

自噬是溶酶體對細胞內受損的細胞器和大分子蛋白進行降解的主要途徑。它通過消化受損的線粒體、抑制活性氧的產生、維持染色體的穩定等方式保護細胞免受有害物質的損傷，延長細胞壽命〔6〕。凋亡是細胞應激條件下，由基因調控的主動且有序的自我消亡過程。凋亡可清除機體受損和突變的細胞，是維持機體正常生理活動所必需的，但過度凋亡會引起神經退行性疾病〔7〕。自噬和凋亡同屬于主動性死亡，雖然二者在形態特征、分子機制、生化指標等方面不盡相同，但兩者并非相互獨立。大量研究發現，自噬與凋亡在發生發展過程中存在一些共同的調節因子和聯系蛋白，并在一定條件下可以交互作用、相互轉換，在組織和機體新陳代謝、損傷修復中發揮重要作用，二者失衡與諸多疾病發生、發展及預后密切相關，尤其是加速了衰老進程〔8〕。研究發現〔9〕，AHL與耳蝸毛細胞自噬的減弱及凋亡的增強有關，因此，調控耳蝸毛細胞自噬與凋亡的平衡可能是治療AHL的重要靶點。

補腎活血湯具有滋補腎精、活血化瘀的功效，與AHL腎虛血瘀的病機相結合，能有效延緩老年人的聽力下降，是治療AHL的傳統方劑。臨床研究發現補腎活血湯聯合針刺頸項九針治療AHL，不僅能促進患者聽力的恢復，而且能改善患者的臨床癥狀及血液流變學指標，從而提高患者的生活質量，臨床療效顯著〔10〕。實驗研究也發現，補腎活血湯可通過調節細胞自噬與凋亡來實現對其他疾病的治療〔11〕，但是罕見補腎活血湯治療AHL機制方面的研究。

本研究結果提示補腎活血湯能夠以濃度依賴性的方式促進HEI-OC1細胞的增殖、增強細胞活力并降低細胞的凋亡率。Bax是與凋亡關系最密切的促凋亡基因，Bcl-2則是抑凋亡基因，對Bax產生阻抑作用〔12〕。Huang等〔13〕發現mir-34a/bcl-2信號通路介導的耳蝸HEI-OC1細胞凋亡，在聽覺細胞老化的中發揮了重要作用，可能是AHL發生的潛在機制。本研究結果提示補腎活血湯可提高衰老HEI-OC1細胞的存活率，其機制可能與補腎活血湯阻滯耳蝸HEI-OC1細胞過度凋亡有關。

Atg5、Atg12和Beclin1是自噬發生過程自噬體形成的依賴性基因，其中Atg5和Atg12結合在一起，定位在自噬體雙層隔離膜的整個延長階段，是自噬體膜的標志性分子，而Beclin1可招募其他蛋白形成自噬體，是啟動自噬的關鍵，這三者的缺失會抑制自噬的發生〔14〕。p62能與微管相關蛋白1輕鏈(LC)3-Ⅱ蛋白形成復合物，并被轉入自噬溶酶體內降解，因此p62是一個與自噬活性呈負相關的標志蛋白〔15〕。Xiong等〔16〕利用衰老HEI-OC1細胞研究發現，sirt1因子的沉默可抑制自噬，促進HEI-OC1細胞的死亡和加速聽力損失，提示自噬受損在AHL的進展中起重要作用。本研究提示補腎活血湯可通過減輕耳蝸細胞自噬水平的減退來延緩衰老。

綜上，補腎活血湯能通過激活自噬、抑制凋亡提高衰老HEI-OC1細胞的增殖能力，改善細胞的衰老狀態，起到了對AHL神經細胞的保護作用，但自噬與凋亡發生、發展和相互作用的機制非常復雜，本文僅就補腎活血湯對自噬和凋亡的影響進行了體外研究，至于其是通過何種通路來調控自噬與凋亡之間的平衡，從而發揮保護耳蝸細胞的作用等問題，將是下一步研究與探索的重點。