人參皂苷Rb1介導TLR3/TRIF信號通路對哮喘大鼠的抗炎作用機制

吳倩 鄭秀花 劉亞麗

(1河南護理職業學院內科教研室，河南 安陽 455000；2平頂山學院醫學院)

哮喘是一種高度流行的慢性呼吸道疾病，嚴重危害人類健康，由于哮喘的發病機制尚未明確，目前的治療只能控制癥狀〔1,2〕。進一步闡明哮喘的發病機制并尋求更有效的治療方法是目前研究的熱點。氣道炎癥反應是哮喘的重要病理特征，并且是不可逆氣流阻塞的病理基礎〔3,4〕。氣道平滑肌細胞(ASMC)的炎癥和肥大導致的氣道平滑肌質量增加在哮喘氣道高反應性和重塑的病理生理中起重要作用。Toll樣受體(TLR)3可識別細菌、病毒、真菌病原體的配體，一旦識別出特定的致病性配體，信號轉導級聯就會被幾個銜接分子激活〔5〕。含Toll樣/白細胞介素-1受體(TIR)結構域的β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TRIF)是髓樣分化因子(MyD)88獨立反應的銜接分子〔6,7〕。TLR3是病毒合成產生的雙鏈RNA的受體，并且TLR3激活會導致以干擾素產生為特征的抗病毒反應及核因子(NF)-κB、干擾素調節因子(IRF)3信號轉導〔8〕。人參皂苷Rb1是一種固醇類化合物主要存在于人參屬藥材中，被廣泛用于腦血管病、冠心病的治療〔9,10〕，但其在哮喘疾病中的效果尚未有研究。本研究擬探討人參皂苷Rb1介導TLR3/TRIF信號通路對哮喘大鼠模型的抗炎作用機制，為哮喘的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 80只SPF級SD大鼠，雌雄各半，8周齡，體重190～220 g，由重慶醫科大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK(渝)2018-0013，動物使用許可證號：SYXK(渝)2018-0017，動物質量合格證號：2020031607，將大鼠圈養在溫度為20～25℃，相對濕度為50%～70%的無病原籠中，自由飲食、飲水。

1.2主要試劑及儀器 人參皂苷Rb1(原料藥，純度99%，河南萊爾茵生物科技有限公司，批號SAS20191013)；地塞米松(廣東華南藥業集團有限公司，規格0.75 mg/片，批號20191217)；卵白蛋白、氫氧化鋁凝膠(美國Sigma-Aldrich公司，批號L10114、L10274)；Trizol試劑、反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司，批號15596-026、10296-010)；SYBR Green qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司，批號SJ6038-5)；放射免疫沉淀分析緩沖液、聚偏二氟乙烯膜、TBST緩沖液(上海羽朵生物科技有限公司，批號DF2014、DF2039、DF3604)；羊抗鼠TLR3、TRIF、β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國Abcam公司，批號ab65498、ab25418、ab10013)；辣根過氧化物酶耦聯的二抗、電化學發光(ECL)試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號A0192、DS2011)；全自動血液分析儀(日本希森美康公司，型號XS-500i)；血氣分析儀(德國西門子公司，型號Rapidlab 800)；顯微鏡(北京京昊永成商貿有限公司，型號JS-750T)；實時熒光定量PCR儀(英濰捷基上海貿易有限公司，型號7300Plus)；凝膠成像儀(上海嘉鵬科技有限公司，型號ZF-388)。

1.3動物分組、造模及給藥 將大鼠按隨機數表法分成5組：對照組、模型組、地塞米松組(1 mg/kg)〔11〕、人參皂苷Rb1低劑量組(100 mg/kg)、人參皂苷Rb1高劑量組(200 mg/kg)〔12〕，每組16只。除對照組外，其余各組大鼠分別于第1天和第8天腹腔注射氫氧化鋁凝膠(20 mg)和10%卵白蛋白(20 μg)溶液0.2 ml，第15天起開始每天霧化吸入2%的卵白蛋白溶液30 min誘發哮喘，每天1次，持續14 d，當大鼠出現前肢撓鼻、嗆咳、呼吸加快、呼吸幅度加大、腹肌抽搐、行動遲緩等表示激發成功〔13〕。對照組大鼠第1天和第8天腹腔注射0.2 ml生理鹽水，第15天起每天霧化吸入生理鹽水。從第15天開始，每日霧化后，地塞米松組大鼠灌胃1 mg/kg的地塞米松，人參皂苷Rb1低、高劑量組大鼠分別灌胃100 mg/kg、200 mg/kg的人參皂苷Rb1，對照組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，灌胃體積均為10 ml/kg，每天1次，連續給藥14 d。

1.4淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、動脈血氧分壓(PaO2)、肺/體比值水平測定 末次給藥后24 h處死大鼠，收集大鼠腹主動脈血液樣品，采用全自動血液分析儀測定淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞水平；使用血氣分析儀測定血液樣品中PaO2水平；獲取大鼠完整雙肺組織，稱量肺濕重，計算肺/體比值，肺/體比值=肺濕重(mg)/大鼠體重(g)×100%。

1.5大鼠肺組織病理學觀察 取大鼠右肺部分肺組織制成石蠟切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.6實時熒光定量PCR法測定大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達水平 將部分肺組織勻漿化，Trizol試劑提取肺組織中總RNA，采用高容量cDNA反轉錄試劑盒將2 μg總RNA反轉錄為cDNA，使用SYBR Green qPCR Mix試劑進行定量PCR。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，引物序列如下：TLR3正向5′-CTTCCTCCCTTTAACTTATCCATTCAC-3′，TLR3反向5′-GCCTTCCTCCACCATTACCAACAATGA-3′；TRIF正向5′-ATGATGAGCAGCATTGTACAGG-3′；TRIF反向5′-GCAGGGTCCGAGGTATTCGTAC-3′；β-actin正向5′-CTGTGTACTGAGCATTCCTGTGACT-3′，β-actin反向5′-AGCCTCCTGTAGAGCTGTGACTGAA-3′。PCR循環條件如下：95℃持續5 min，然后進行40個循環(95℃ 30 s、60℃20 s、72℃ 20 s)。反應體系：正向引物1 μl、反向引物1 μl、cDNA 2 μl、SYBR Green qPCR Mix 3 μl、雙蒸水(ddH2O)8 μl。使用β-actin進行標準化，2-ΔΔCt法計算TLR3、TRIF mRNA表達水平。

1.7蛋白免疫印跡法測定大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達水平 將部分肺組織勻漿化，使用放射免疫沉淀分析緩沖液從肺組織中提取總蛋白，蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度，并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上，在室溫下用5%脫脂牛奶將膜封閉1 h，在TBST緩沖液中洗滌3次，然后與TLR3(1∶1 000)、TRIF(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗在4℃孵育過夜，將膜與二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h，采用ECL試劑盒顯色，在凝膠成像儀中觀察蛋白條帶并拍照。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠肺/體比值、PaO2水平比較 與對照組比較，模型組大鼠肺/體比值明顯升高，PaO2水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組大鼠肺/體比值顯著降低，PaO2水平顯著升高(P<0.05)；且人參皂苷Rb1高劑量組大鼠肺/體比值顯著低于人參皂苷Rb1低劑量組，PaO2水平顯著高于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，人參皂苷Rb1低劑量組大鼠肺/體比值顯著升高，PaO2水平顯著降低(P<0.05)；人參皂苷Rb1高劑量組與地塞米松組大鼠肺/體比值、PaO2水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組肺/體比值、PaO2水平比較

2.2各組大鼠血液淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血液淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組大鼠血液淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞水平顯著降低(P<0.05)；且人參皂苷Rb1高劑量組大鼠血液淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞水平顯著低于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，人參皂苷Rb1低劑量組大鼠血液淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞水平顯著升高(P<0.05)；人參皂苷Rb1高劑量組與地塞米松組大鼠血液淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組大鼠肺組織HE染色比較 對照組肺泡結構無異常；模型組氣道異常狹窄，炎癥細胞浸潤明顯，平滑肌增厚明顯；地塞米松組、人參皂苷Rb1高劑量組肺泡結構基本正常，氣道上皮細胞增生明顯減輕，管腔大小正常，有少量炎癥細胞浸潤；人參皂苷Rb1低劑量組管腔狹窄，有炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.4各組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；且人參皂苷Rb1高劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達水平顯著低于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，人參皂苷Rb1低劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；人參皂苷Rb1高劑量組與地塞米松組大鼠肺組織中TLR3、TRIF mRNA表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組血液淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞水平及肺組織中TLR3、TRIF mRNA比較

2.5各組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；且人參皂苷Rb1高劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達水平顯著低于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，人參皂苷Rb1低劑量組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；人參皂苷Rb1高劑量組與地塞米松組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表3。

1～5：對照組，模型組，地塞米松組，人參皂苷Rb1低劑量組，人參皂苷Rb1高劑量組圖2 各組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達

表3 各組大鼠肺組織中TLR3、TRIF蛋白表達水平比較

3 討 論

哮喘是全球常見的炎性呼吸系統疾病，其特征是氣道炎癥、氣道壁重塑和氣道高反應性〔14〕。氣道炎癥是氣道壁重塑和氣道高反應性的病理學基礎。研究發現〔15〕，人參皂苷Rb1以劑量依賴的方式抑制細胞外信號調節激酶(ERK)的轉導途徑和人ASMC的增殖、炎癥反應，從而防止氣道重塑的發生。人參皂苷Rb1還可顯著下調哮喘大鼠模型中Ca2+通道蛋白的活性，對哮喘發揮預防和治療作用〔16〕。本研究結果說明人參皂苷Rb1減輕了哮喘模型大鼠肺部炎癥反應，且人參皂苷Rb1高劑量組與地塞米松具有相似的效果。

TLR在髓樣和非髓樣細胞(包括上皮細胞)上均表達。ASMC細胞位于氣道外表，除了提供物理屏障功能外，它們還通過促炎性細胞因子、趨化因子和抗菌肽介導對微生物產物的免疫反應。此外，ASMC表達幾種TLR，并且可以在體外對TLR2、TLR3和TLR5激動劑作出反應〔17〕。研究表明，TLR3在ASMC中表達，并可以通過MyD88銜接分子介導氣道炎癥。TRIF是TLR3的下游因子，存在于哺乳動物呼吸系統的各個部分，包括氣管感覺神經、ASMC、上皮細胞、肺血管內皮細胞、肺動脈平滑肌細胞、黏膜下腺和炎性細胞。研究表明，TRIF在咳嗽反射中起著至關重要的作用〔18〕。當TRIF被激活時，它誘導Ca2+流入神經細胞，導致膜去極化達到閾值電位，進而導致支氣管收縮、黏液分泌和咳嗽反射。此外，TRIF通道激活引起的Ca2+流入可能觸發速激肽(TK)和降鈣素基因相關肽(CGRP)在周圍和中樞神經系統中的釋放，導致支氣管收縮，氣管黏膜水腫和炎癥細胞趨化因子生成。TRIF通道與哮喘高度相關，因為TRIF通道的遺傳決定因素的水平和活性影響哮喘的發生病理生理過程。缺氧顯著增加人肺動脈平滑肌細胞中TRIF mRNA和蛋白表達，從而導致胞質Ca2+濃度增加，進而導致細胞過度增殖〔19,20〕。本研究結果說明人參皂苷Rb1減輕哮喘大鼠肺部炎癥反應的機制可能與其抑制肺組織中TLR3、TRIF mRNA和蛋白表達水平有關。

綜上所述，人參皂苷Rb1可降低哮喘模型大鼠肺部炎癥反應，其機制可能與人參皂苷Rb1抑制哮喘大鼠肺部TLR3、TRIF mRNA和蛋白表達水平進而抑制TLR3/TRIF信號通路的激活有關。