活性維生素D3對阿霉素腎病模型大鼠足細胞及特異性損傷因子desmin的影響

馬國英 趙丹 陳亞茹 劉馨馨 羅星

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1生化教研室，新疆 石河子 832002;2第一附屬醫(yī)院腎病科)

慢性腎臟病是一種以腎小球損傷和蛋白尿為主要特征的臨床常見疾病，也是造成終末期腎衰竭的主要原因之一。慢性臟腎病患者維生素D缺乏癥的患病率較高，進而影響患者鈣磷代謝，引起骨骼和心血管疾病〔1〕。當(dāng)使用活性維生素D3〔1，25-(OH)2D3〕治療時可減少蛋白尿，減輕腎臟損傷〔2〕。足細胞作為毛細血管上皮細胞與內(nèi)皮細胞和基底膜組成腎濾過屏障，當(dāng)足細胞損傷時造成濾過屏障受損，蛋白質(zhì)濾過形成蛋白尿，加重腎損傷〔3〕。desmin作為足細胞損傷時特異性分泌的因子，可用來評價足細胞損傷的程度〔4〕。本實驗使用1，25-(OH)2D3對阿霉素腎臟病模型大鼠進行干預(yù)，觀察1，25-(OH)2D3對足細胞及desmin的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 雄性SPF級SD大鼠90只，體重200～220 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心〔許可證號：SCXK(新)2013-0001〕。

1.1.2主要藥物和試劑 鹽酸阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司)；骨化三醇(上海羅氏制藥有限公司)；desmin兔單抗(美國Abcam公司，產(chǎn)品代碼ab212951)；GAPDH鼠單抗(北京康為世紀有限公司)；山羊抗兔、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋有限責(zé)任公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(丹麥 DAKO 公司)。

1.1.3主要儀器 全自動生化分析儀(深圳邁瑞醫(yī)療國際有限公司)；T1SCN電子秤(德國 Sartorius 公司)；電泳及電轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；GL離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；BX43光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1阿霉素腎臟病模型的建立 隨機選取30只大鼠為對照組，其余分為模型組和治療組，每組30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。模型組和治療組單次尾靜脈注射阿霉素7.5 mg/kg建立阿霉素腎臟病模型，對照組注射等量的生理鹽水。注射2 w后進行24 h尿蛋白定量檢測及血生化檢測判斷建模效果。

1.2.2給藥 阿霉素腎臟病模型建立前2 d開始，治療組0.25 μg/(kg·d)1，25-(OH)2D3溶于花生油中進行灌胃治療，對照組和模型組使用等量的花生油灌胃，治療期間大鼠自由飲食。

1.3相關(guān)檢測指標

1.3.1一般狀況 ①觀察大鼠活動、休息、日常飲食、排尿排便等生活習(xí)性的變化;②24 h尿蛋白(UTP) 定量:在代謝籠中獨立喂養(yǎng)大鼠，收集24 h尿液，檢測尿蛋白水平；③使用腹主動脈采血的方法檢測總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、總膽固醇(TC)。

1.3.2大鼠腎臟病理觀察 使用劑量為0.35 ml/100 g的10%水合氯醛進行麻醉處理，將腹腔剖開迅速剝離雙腎，去除腎被膜，固定在10%的甲醛中，部分組織使用石蠟包埋，切片后烘烤2 h固定組織，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.3.3Masson染色 石蠟包埋的腎組織切片，65℃烤片，使用二甲苯脫蠟、酒精脫至水性。使用核染液染色60 s，漿染液染色30～60 s，分色液6～8 min，苯藍/光綠液復(fù)染5 min左右，梯度酒精脫水，晾干，封片。

1.3.4免疫組織化學(xué)、熒光染色 將腎組織石蠟切片脫蠟、浸入枸櫞酸鹽中使用高壓鍋加熱進行抗原修復(fù)，過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，滴加desmin抗體(1∶300)4℃孵育過夜。組化染色滴加辣根過氧化物酶標二抗，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片，光鏡下觀察；熒光染色使用熒光二抗標記，DAPI進行核標記，熒光顯微鏡下觀察。免疫組化切片隨機選取5個腎小球視野，使用Image-pro plus進行掃描，以陽性區(qū)域積分光度與腎小球面積的比值代表desmin的相關(guān)表達量。

1.3.5Western印跡 取出-80℃凍存的腎組織切出皮質(zhì)部分100 mg，加1 ml裂解液研磨(PMSF與RIPA以1∶100的比例混合)，所有過程要求在冰上操作。充分研磨后離心留取上清，蛋白濃度使用二喹啉甲酸(BCA)測量，配平。加入上樣緩沖液，100℃煮8 min。加樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣量50 μg/孔，濃縮膠設(shè)定電壓為83 V，時間30 min；分離膠設(shè)定電壓為100 V，時間1 h；半干轉(zhuǎn)電壓23 V，時間100 min；5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加一抗(desmin 稀釋比例1∶5 000，GAPDH稀釋比例 1∶1 000)4℃冰箱搖床上孵育過夜，TBST洗去多余一抗，desmin山羊抗兔二抗(1∶5 000)和GAPDH山羊抗小鼠二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST 洗去多余二抗，暗室曝光，Image軟件處理掃描圖像，以desmin條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值的比值對圖像進行量化。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS20.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般體征比較 對照組大鼠體型發(fā)育正常，較活潑，對應(yīng)激反應(yīng)強烈；模型組大鼠精神不佳、消瘦，怠倦少動、喜蜷臥，飲食減少，多尿以致墊料易潮濕，毛色粗糙無光澤；相較于模型組，治療組大鼠精神狀況、反應(yīng)及外在體征等均有明顯改善。

2.2各組尿蛋白定量與生化檢測指標比較 與對照組相比，模型組和治療組24 h UTP、BUN、Cr、TC水平均顯著升高，而TP、Alb水平均顯著下降(均P<0.05)。阿霉素腎臟病模型建造成功，見表1。

表1 造模2 w末各組血、尿生化指標水平比較

2.31,25-(OH)2D3S對腎病理損傷的影響 HE染色可進一步觀察腎病理損傷，證明造模效果，HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組多數(shù)腎小球出現(xiàn)體積固縮，染色變深，腎小球呈節(jié)段性硬化現(xiàn)象，腎小囊間隙增加存在炎性細胞浸潤，周圍鄰近的腎小管萎縮，使用1，25-(OH)2D3治療后，腎小球損傷明顯減輕。見圖1。Masson染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組腎小球膠原纖維增多，基底膜層增厚，腎間質(zhì)中呈纖維樣壞死的面積增加，治療組經(jīng)處理后，膠原纖維減少，腎組織損傷減輕。見圖1。

圖1 第2周與第10周各組腎病理損傷(×400)

2.41,25-(OH)2D3對腎組織中desmin染色分布及表達的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示，desmin 陽性染色呈棕黃色顆粒，主要表達在細胞質(zhì)。各時間段中的對照組少見 desmin 陽性表達，第2、4、6、8、10 周中，模型組desmin 表達呈黃褐色片狀分布，較同周對照組表達顯著增加(P<0.05)，自第2周起，治療組黃色沉積逐漸變淡，較同周模型組desmin陽性表達明顯降低(P<0.05)，見表2，圖2，圖3。

表2 不同時間點各組大鼠腎組織染色觀察desmin表達水平

圖2 不同時間點各組desmin蛋白表達(DAB，×400)

圖3 不同時間點各組desmin蛋白熒光定位(IF，×400)

2.51,25-(OH)2D3對足細胞 desmin 蛋白表達量的影響 自第2周起，與同周對照組相比，模型組desmin 表達量明顯升高(P<0.05)，治療組較同周模型組 desmin 表達顯著降低(P<0.05)，至第 10 周接近正常水平，見圖4，表3。

1～3：對照組，模型組，治療組圖4 不同時間點各組desmin蛋白表達量變化

表3 各組desmin蛋白相對表達量

3 討 論

腎小球損傷與慢性腎臟病的發(fā)展密切相關(guān)，隨年齡增長腎功能減弱，硬化腎小球數(shù)量增多，腎臟受損程度逐漸增加〔5〕。足細胞是腎小球毛細血管上皮細胞，是腎濾過屏障的組成成分，足細胞損傷時可通過引發(fā)“殘余”完整足細胞繼發(fā)性損傷〔6〕，使足細胞損傷形成惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致足細胞惡化和腎小球硬化，進而增加腎損傷程度，增加蛋白尿〔7〕。阿霉素腎臟病模型是腎小球相關(guān)疾病的研究模型，以腎小球和足細胞損傷為主〔8〕。desmin是細胞骨架絲蛋白，當(dāng)足細胞受損時，可引起骨架的重新排列，導(dǎo)致足細胞desmin的高表達，在正常足細胞和腎小球其他細胞中少量表達或幾乎不表達，因此desmin可作為標記足細胞損傷的因子之一〔9〕。有實驗表明，在嘌呤霉素氨基核苷酸腎臟病模型中受損足細胞的desmin表達升高〔10〕。本結(jié)果顯示在阿霉素腎臟病模型組大鼠中隨著腎組織的損傷時間增加，desmin的表達增加。

1，25-(OH)2D3是可調(diào)節(jié)鈣磷代謝的脂溶性維生素，有研究結(jié)果顯示1，25-(OH)2D3有一定的腎臟保護作用〔11,12〕。在慢性腎臟病早期1，25-(OH)2D3含量明顯減少〔13〕，使用1，25-(OH)2D3治療有助于慢性腎臟病的恢復(fù)〔14〕。nephrin作為足細胞裂孔膜相關(guān)蛋白其表達量同樣可評估足細胞損傷的程度，而使用1，25-(OH)2D3治療可增加nephrin的表達，保護由高血壓腎病造成的足細胞損傷，減少蛋白尿〔15〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1，25-(OH)2D3可降低足細胞中desmin的表達，對足細胞起到一定程度的保護作用。

慢性腎臟病是一類臨床常見的慢性疾病，其誘因多樣，當(dāng)發(fā)展為終末期腎臟病時常常難以治愈，需進行長期透析治療或腎移植，給患者帶來巨大的痛苦與經(jīng)濟負擔(dān)〔16〕。本研究結(jié)果表明，1，25-(OH)2D3在一定程度上可保護阿霉素腎臟病大鼠足細胞，緩解模型大鼠的病理癥狀，減少蛋白尿，減輕足細胞與腎組織損傷，而1，25-(OH)2D3對足細胞產(chǎn)生保護作用的具體作用機制還有待進一步研究。