黃芩苷對肺癌H460細胞生物學特性及Wnt/β-catenin信號通路的影響

侯從嶺 雷小婷 蘆曉帆 周超鋒 李彬

(河南省中醫院 1肺病科，河南 鄭州 450002；2腫瘤科)

肺癌是具有高發病率和死亡率的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關死亡的主要原因。非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌中75%～85%，包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞肺癌〔1〕。目前盡管外科手術聯合放、化療取得了進展，但NSCLC患者的預后仍然很差，所有階段和亞型的肺癌患者5年生存率仍然低至11%〔2〕。轉移和復發是導致肺癌患者死亡的主要原因，且放療和化療對患者的毒副作用較大，嚴重影響患者生活質量并制約治療效果〔3〕。因此迫切需要尋找新的、安全有效、毒副作用低的抗癌劑。黃芩苷是從中藥黃芩中提取出來的一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理作用，如抑菌、抗炎和抗癌等多種生理效能〔4,5〕。黃芩苷的抗癌作用已在不同類型的癌細胞中得到證實，包括乳腺癌細胞、肝細胞癌細胞及卵巢癌細胞〔6～8〕。體內研究表明，黃芩苷對結腸癌、鼻咽癌等具有顯著的治療作用〔9,10〕。但關于黃芩苷對人肺癌H460細胞生物學特性的影響及分子機制的研究鮮有報道。本研究體外培養H460細胞，觀察不同濃度的黃芩苷對H460細胞增殖、凋亡、上皮間質轉化(EMT)、侵襲和遷移的影響，并探究其對Wnt/β-catenin信號通路活性的影響，以期為黃芩苷在肺癌臨床應用中提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 黃芩苷純度>99.90%(上海源葉生物科技有限公司)；人肺癌細胞株H460(中國科學院上海生科院生物化學與細胞學研究所)；胰蛋白酶、RPMI1640培養基、小牛血清(美國Gibco公司)；CCK-8試劑(上海碧云天生物技術研究所)；膜聯蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；RNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；反轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(美國Gene-Foci Biotech公司)；孔徑8 μm的Transwell小室、基質膠(美國BD公司)；增殖細胞核抗原(PCNA)抗體、Wnt1抗體、β-連環蛋白(catenin)抗體(美國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、MMP-9抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2細胞培養 人肺癌H460細胞常規復蘇后接種在含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養液的培養瓶中，將培養瓶放置在飽和濕度、5%CO2、37℃細胞恒溫培養箱中培養，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態，及時更換新鮮的培養液，細胞長滿瓶底90%時，以胰蛋白酶消化H460細胞，以1∶3進行傳代。處于對數生長期的H460細胞用于實驗。

1.3CCK-8法檢測黃芩苷對H460細胞增殖的影響 將對數生長期的H460細胞以胰酶消化，按照1×104個/孔接種到96孔板中，放置在常規培養箱中繼續培養，待細胞充分貼壁后除去舊培養液，分別加入含不同濃度(0、25、50、100、150、200、250 μmol/L)黃芩苷的新鮮培養液，每個濃度組設置4個平行復孔，其中0 μmol/L為對照組。在37℃培養箱中繼續孵育48 h，參照CCK-8試劑盒說明書向每孔細胞中加入100 μl CCK-8溶液，37℃繼續孵育4 h，使用全自動酶標儀檢測波長為450 nm處各孔H460細胞吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%，并計算黃芩苷對細胞的半數抑制濃度(IC50)。

1.4流式細胞術檢測黃芩苷對H460細胞凋亡的影響 對數生長期的H460細胞以胰酶消化，使用培養液重懸細胞并接種到6孔板中，放置在細胞培養箱常規培養，待細胞貼壁后更換成含不同濃度(0、25、50 μmol/L)黃芩苷的培養液，處理48 h，收集細胞，按照AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒說明書處理細胞，使用流式細胞儀檢測各濃度組H460細胞凋亡情況。

1.5qRT-PCR檢測黃芩苷對H460細胞EMT標志基因表達的影響 對數生長期的H460細胞以1×106個/孔接種到6孔板中，加入不同濃度(0、25、50 μmol/L)的黃芩苷干預48 h，收集細胞，使用RNA提取試劑盒提取各組細胞中總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，使用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增檢測目的基因相對表達量。上皮型鈣黏附素(E-cadherin)上游引物：5′-CGTAGCAGTGACGAATGTGG-3′，下游引物：5′-CTGGGCAGTGTAGGATGTGA-3′； 神經性鈣黏附素(N-cadherin)上游引物：5′-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3′，下游引物：5′-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3′； 波形蛋白(Vimentin)上游引物：5′-GAGTCCACTGAGTACCGGAG-3′，下游引物：5′-ACGAGCCATTTCCTCCTTCA-3′； β-actin上游引物：5′-AAACTGGAACGGTGAAGGTG-3′，下游引物：5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′。實驗數據采用相對定量2-△△Ct法計算，以β-actin為內參。

1.6劃痕實驗檢測黃芩苷對H460細胞遷移能力的影響 對數期的H460細胞以1×106個/孔均勻的種植到6孔板中，放置在恒溫培養箱培養，待細胞貼壁匯合度到90%以上時，棄去培養上清液，使用滅菌的移液槍槍頭在各孔中間垂直劃橫線，以PBS洗去劃掉的細胞，分別向各孔細胞中加入含不同濃度(0、25、50 μmol/L)黃芩苷的無血清培養液，37℃培養箱繼續培養48 h，使用倒置顯微鏡觀察黃芩苷干預后H460細胞愈合情況，計算劃痕愈合率=(初始劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.7Transwell實驗檢測黃芩苷對H460細胞侵襲能力的影響 取100 μl稀釋的基質膠添加到Transwell小室的上室，37℃放置過夜，備用。收集對數期的H460細胞，加入無血清培養液重懸細胞，分別加入不同濃度(0、25、50 μmol/L)黃芩苷，取200 μl細胞懸液加入到Transwell小室的上室，下室加入700 μl含10%小牛血清的培養液，37℃培養箱培養48 h。用棉簽小心擦去上室未穿膜的細胞，以4%多聚甲醛固定30 min，1%結晶紫染色10 min，PBS洗去染液，風干后在倒置顯微鏡(×100)下隨機取5個視野，觀察并計數侵襲細胞數。

1.8Western印跡檢測檢測黃芩苷對H460細胞中蛋白表達的影響 以不同濃度(0、25、50 μmol/L)黃芩苷干預H460細胞48 h，分別收集各濃度組細胞，加入RIPA細胞裂解液，在冰上裂解提取細胞中總蛋白。使用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。按照每孔40 μg蛋白樣品上樣，行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，蛋白分離后轉膜、封閉，分別加入相應稀釋的一抗，4℃孵育過夜，再加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h，以電化學發光(ECL)顯影，使用凝膠成像系統拍照，將目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值為目的蛋白相對表達水平。

1.9統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1黃芩苷對H460細胞增殖的抑制作用 0、25、50、100、200、400 μmol/L黃芩苷細胞增殖抑制率分別為：(0.00±0.00)%、(9.26±2.04)%、(18.38±4.52)%、(37.61±5.11)%、(50.49±6.02)%、(68.54±6.88)%。隨著黃芩苷濃度的增加，對H460細胞增殖抑制率逐漸升高，且具有一定的濃度依賴關系(F=91.829，P=0.000)。計算得出黃芩苷對H460細胞IC50為(188.1±11.52)μmol/L，因此選擇1/2 IC50以下2個低毒濃度(25和50 μmol/L)為后續實驗加藥標準濃度。

2.2黃芩苷對H460細胞凋亡的影響 與0 μmol/L組〔(5.60±0.31)%〕相比，25 μmol/L組〔(18.33±2.08)%〕和50 μmol/L組〔(33.61±8.54)%〕組H460細胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)；與25 μmol/L組相比，50 μmol/L組H460細胞的凋亡率升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測各組H460細胞凋亡

2.3黃芩苷對H460細胞EMT的影響 與0 μmol/L組相比，25 μmol/L組和50 μmol/L組H460細胞中E-cadherin基因表達水平顯著升高(P<0.05)，N-cadherin和Vimentin基因表達水平顯著降低(P<0.05)；與25 μmol/L組相比，50 μmol/L組H460細胞中E-cadherin基因表達水平組升高(P<0.05)，N-cadherin和Vimentin基因表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度黃芩苷對H460細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin基因表達的影響

2.4黃芩苷對H460細胞遷移和侵襲的影響 與0 μmol/L組相比，25 μmol/L組和50 μmol/L組H460細胞劃痕愈合率和侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05)；與25 μmol/L組相比，50 μmol/L組H460細胞劃痕愈合率和侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度黃芩苷對H460細胞遷移和侵襲的影響

2.5黃芩苷對H460細胞中PCNA、Bax、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 與0 μmol/L組相比，25 μmol/L組和50 μmol/L組H460細胞中PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白水平明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與25 μmol/L組相比，50 μmol/L組H460細胞中PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白水平明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 Western印跡檢測H460細胞中PCNA、Bax、MMP-2和MMP-9蛋白水平

表3 不同濃度黃芩苷對H460細胞中PCNA、Bax、MMP-2、MMP-9、Wnt1及β-catenin蛋白表達的影響

2.6黃芩苷對Wnt/β-catenin信號通路活性的影響 與0 μmol/L組相比，25 μmol/L組和50 μmol/L組H460細胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達水平均明顯下調(P<0.05)；與25 μmol/L組相比，50 μmol/L組H460細胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達水平均明顯下調(P<0.05)。見表3、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組H460細胞中Wnt1和β-catenin蛋白水平

3 討 論

目前的治療措施在治療人類肺癌方面盡管取得了進展，但肺癌仍然是人類癌癥死亡的主要原因。因此，治療肺癌患者需要更有效的藥物及療法。傳統中醫在中國和東亞地區很受歡迎，并在現代醫療系統中發揮積極作用，包括治療癌癥患者，因此可被認為是治療人類癌癥的潛在有效策略〔11〕。天然傳統中藥歷來是抗癌藥物的重要來源，其中一些目前已用于臨床實踐〔12,13〕。中藥因其高效且毒性較小，因此作為潛在的治療劑被廣泛研究。黃芩苷是一種從中藥黃芩中提取的有效活性物質，目前已被證實其具有廣泛抗癌作用〔14〕。龍進〔15〕報道顯示，黃芩苷對肺腺癌A549細胞具有明顯的增殖抑制和凋亡誘導作用；郭愛萍等〔16〕發現黃芩苷能夠抑制A549細胞增殖和遷移。PCNA在細胞增殖啟動中發揮重要作用，目前已將其作為腫瘤細胞處于增殖狀態的指標之一〔17〕。Bax屬于Bcl-2家族成員，其具有細胞凋亡促進的作用，目前多用于腫瘤研究〔18〕。本實驗提示黃芩苷能夠能夠下調PCNA的表達抑制細胞增殖，通過上調Bax蛋白表達誘導細胞凋亡。

EMT的特征在于上皮特征的喪失和間充質特征的獲得，間充質標記物(包括N-cadherin和Vimentin)的誘導分別是EMT的標志性事件〔19,20〕。本研究結果表明黃芩苷抑制EMT，正如N-cadherin和Vimentin基因表達水平降低，上皮標志物E-cadherin基因表達水平升高所示。眾所周知，EMT與癌癥轉移密切相關〔21〕。因此，黃芩苷抑制肺癌H460細胞EMT過程可能是黃芩苷抑制H460細胞侵襲和轉移的潛在機制。此外本研究劃痕愈合和Transwell實驗結果發現，黃芩苷可抑制H460細胞遷移和侵襲能力。MMP能夠降解細胞外基質(ECM)和基底膜的各種組分。MMP-2和MMP-9均屬于MMP家族，一旦MMP-2和MMP-9被激活，它們就能夠降解ECM中的膠原蛋白，從而增加癌細胞的侵襲和轉移〔22,23〕。本實驗Western blot結果顯示，黃芩苷誘導的H460細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平顯著降低。因此，黃芩苷誘導的MMP-2和MMP-9蛋白表達的抑制可被認為是黃芩苷抑制肺癌細胞侵襲和轉移的重要機制。有報道稱，黃芩苷通過調控Wnt/β-catenin信號通路促進毛囊發育及胚胎粘連和植入〔24,25〕。提示黃芩苷可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路發揮抑癌作用。Wnt/β-catenin信號通路屬于經典的Wnt信號通路，在多種細胞增殖、分化、發育、侵襲和遷移過程中發揮關鍵作用〔26〕。Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤發生和癌細胞侵襲和遷移中的作用已廣泛應用于包括肺癌在內的多種人類癌癥中〔27,28〕。針對Wnt/β-catenin信號通路可能是一種有效的抗癌策略。最近報道，一些化合物通過在癌細胞中抑制Wnt/β-catenin信號通路而發揮其抑癌作用〔29,30〕。本研究發現，黃芩苷能夠以劑量依賴性下調Wnt/β-catenin信號通路中關鍵蛋白分子Wnt1和β-catenin的表達量，表明黃芩苷處理H460細胞后Wnt/β-catenin信號通路被抑制。提示黃芩苷可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性發揮抑制肺癌的作用。

總之，黃芩苷在肺癌H460細胞中的抑制細胞增殖、EMT、侵襲和轉移及誘導細胞凋亡的作用和機制。黃芩苷通過誘導調控PCNA、Bax、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平表現出影響H460細胞生物學特性的作用。黃芩苷干預H460細胞可抑制Wnt/β-catenin信號通路，進而誘導細胞生長、侵襲、遷移抑制和細胞凋亡。黃芩苷作為治療肺癌的候選者具有巨大的潛力。抑制Wnt/β-catenin信號通路可能是開發新型抗癌藥物的重要策略。