蝦青素提高人膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性的效應(yīng)和機(jī)制

何淼 李超 楊桄權(quán) 陳兆紅

(德陽(yáng)市人民醫(yī)院，四川 德陽(yáng) 618000)

腦膠質(zhì)瘤惡性程度高、發(fā)病率高，約占成人原發(fā)性惡性腦部腫瘤的80%〔1,2〕。星形細(xì)胞瘤是腦膠質(zhì)瘤最主要的組成部分〔3〕。神經(jīng)膠質(zhì)瘤尤其是星形細(xì)胞瘤患者的預(yù)后很差，惡性腦膠質(zhì)瘤的中位生存期僅15個(gè)月〔4,5〕。多種因素促成了腦膠質(zhì)瘤的難治性：膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)極具浸潤(rùn)性，與周邊正常組織難以區(qū)分，導(dǎo)致手術(shù)完全去除瘤體難度極大，手術(shù)切除率很低；腦膠質(zhì)瘤本身的增殖活力高、對(duì)多種凋亡誘導(dǎo)因子具有抗性；由于血腦屏障(BBB)的先天作用，多種化療藥物難以透過(guò)BBB達(dá)到病灶局部的有效藥物濃度〔6〕。放射治療在腦膠質(zhì)瘤治療中占據(jù)重要地位，手術(shù)切除加放療是其標(biāo)準(zhǔn)治療手段，可延長(zhǎng)患者的中位生存期〔7,8〕。隨著先進(jìn)放射治療技術(shù)的突飛猛進(jìn)，放療在腦膠質(zhì)瘤治療當(dāng)中的地位將會(huì)更加重要。然而，放療效果同樣受到手術(shù)切除范圍、化療情況、放療前功能狀態(tài)等多方面的影響〔9〕，且腦膠質(zhì)瘤存在嚴(yán)重的放療抵抗，因而如何在不增加副作用的前提下進(jìn)一步提高放射治療效果進(jìn)而提高患者的生存質(zhì)量是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)〔10〕。由于藥物到達(dá)腦膠質(zhì)瘤病灶需要穿透BBB，而大多數(shù)藥物無(wú)法高效穿過(guò)BBB，病灶局部藥物不足以達(dá)到有效濃度，這一特殊的固有解剖位置成為嚴(yán)重制約靶向腦膠質(zhì)瘤放療增敏劑開(kāi)發(fā)的因素。因此，開(kāi)發(fā)高效低毒的腦膠質(zhì)瘤放療增敏劑意義重大。蝦青素(ATX)是一種類胡蘿卜素，廣泛分布于水生動(dòng)植物當(dāng)中〔11〕。ATX具有強(qiáng)抗氧化作用，大量研究表明其在體內(nèi)外對(duì)多種疾病均具有治療作用，并且?guī)缀鯚o(wú)毒副作用〔12〕。研究表明ATX可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡、自噬、細(xì)胞周期等多種途徑，對(duì)多種癌癥發(fā)揮抗腫瘤潛力，包括口腔癌〔13〕、結(jié)腸癌〔14〕、白血病〔15〕及肝細(xì)胞癌〔16〕等。更重要的是，ATX具有良好的BBB穿透能力，可穿過(guò)BBB深達(dá)腦瘤病灶發(fā)揮藥效。然而ATX是否可對(duì)腦膠質(zhì)瘤發(fā)揮放療增敏作用，至今尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬以人膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251為研究對(duì)象，檢測(cè)ATX對(duì)其放射敏感性的調(diào)控作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251由中科院上海生命科學(xué)研究所提供；ATX購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，并將其10 mg粉末溶解在100 μl二甲基亞砜(DMSO)中后，加入超純水配成濃度為10 g/L的懸液備用；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；蛋白裂解液購(gòu)自美國(guó)Kaygen公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；6 MV X線直線加速器購(gòu)自德國(guó)西門子公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN公司(型號(hào)為Infinite F50)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株在含有10%FBS和100 U/ml青霉-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，并放置于條件為37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，3～4 d進(jìn)行1次傳代。采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞實(shí)施實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞接種在6孔板中(每孔1×105/ml)并分組：未照射對(duì)照組、未照射+5 μmol/L ATX組、未照射+20 μmol/L ATX組、照射對(duì)照組、5 μmol/L ATX+照射組、20 μmol/L ATX+照射組。

1.2.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 將人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞(5 000個(gè)細(xì)胞/孔)接種在96孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)基，以排槍向各孔中加入含不同濃度的100 μl ATX懸液，在作用后24 h加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD值)，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率并擬合曲線從而計(jì)算IC50值。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞按照射劑量不同接種于含3 ml培養(yǎng)基中(按照照射劑量由低到高接種細(xì)胞數(shù)為200、400、800、1 200、1 600個(gè)/孔)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6 h待其貼壁。細(xì)胞貼壁后按照不同濃度進(jìn)行給藥。藥物處理24 h后，以每皿3 ml DMEM高糖培養(yǎng)基換液，將細(xì)胞分別以8 Gy的劑量進(jìn)行X射線照射。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，并在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。13 d后，用甲醇固定細(xì)胞，干燥后以結(jié)晶紫染色10 min，清水緩緩沖去染液，待其干燥。以肉眼計(jì)數(shù)克隆數(shù)：含50個(gè)以上的細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)為1個(gè)克隆，計(jì)算克隆形成率、出種率(PE)，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)。采用Sigma Plot13.0軟件對(duì)克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行曲線擬合及數(shù)據(jù)分析(單擊多靶模型)。

1.2.5細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按6 Gy劑量進(jìn)行照射。照后24 h收集全部細(xì)胞于離心管內(nèi)，以1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌并離心2次。加入500 μl的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞；將5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色溶液混勻后在避光條件下室溫中反應(yīng)15 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用流式細(xì)胞儀自帶軟件分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.6Western印跡 收集細(xì)胞在蛋白裂解液中裂解，在4℃下以12 000 r/min離心20 min。通過(guò)BCA試劑盒定量蛋白濃度，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì)，在4℃下進(jìn)行300 mA恒流轉(zhuǎn)膜。隨后將膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，在4℃下用B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3及β-actin一抗過(guò)夜孵育，加入二抗在室溫下保持1 h，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影曝光檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism6.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1ATX抑制U251細(xì)胞增殖 未照射+5 μmol/L ATX組〔(78.87±4.66)%〕和未照射+20 μmol/L ATX組細(xì)胞存活率〔(65.97±2.35)%〕均明顯低于未照射對(duì)照組〔(93.69±3.56)%，均P<0.05〕。同時(shí)，5 μmol/L ATX+照射組〔(42.85±5.75)%〕和20 μmol/L ATX+照射組細(xì)胞存活率〔(34.79±3.05)%〕均明顯低于照射對(duì)照組〔(67.47±5.22)%，P<0.05〕；且20 μmol/L ATX+照射組細(xì)胞存活率顯著低于5 μmol/L ATX+照射組(P<0.05)。

2.2ATX提高U251細(xì)胞放射敏感性 未照射+5 μmol/L ATX組(0.94±0.02)與未照射對(duì)照組(0.98±0.02)克隆形成能力無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；未照射+20 μmol/L ATX組克隆形成能力(0.81±0.01)明顯低于未照射對(duì)照組(P<0.05)。同時(shí)，5 μmol/L ATX+照射組(0.35±0.06)和20 μmol/L ATX+照射組(0.06±0.01)克隆形成能力明顯低于照射對(duì)照組(0.77±0.01均P<0.05)；且20 μmol/L ATX+照射組克隆形成能力明顯低于5 μmol/L ATX+照射組(P<0.05)。

2.3ATX提高細(xì)胞輻射誘導(dǎo)后U251細(xì)胞凋亡 未照射對(duì)照組〔(3.366±0.364 1)%〕、未照射+5 μmol/L ATX組〔(4.118±0.205 2)%〕和未照射+20 μmol/L ATX組細(xì)胞凋亡率〔(4.750±0.186 7)%〕無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。5 μmol/L ATX+照射組〔(10.684±0.199 5)%〕與20 μmol/L ATX+照射組細(xì)胞凋亡率〔(15.912±0.368 9)%〕明顯高于照射對(duì)照組〔(6.682±0.236 0)%，均P<0.05〕；且20 μmol/L ATX+照射組細(xì)胞凋亡率明顯高于5 μmol/L ATX+照射組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 蝦青素提高細(xì)胞輻射誘導(dǎo)后U251細(xì)胞凋亡

2.4ATX調(diào)節(jié)U251細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá) 未照射對(duì)照組與未照射+5 μmol/L ATX組和未照射+20 μmol/L ATX組3組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。照射對(duì)照組Bcl-2、Bax表達(dá)水平明顯高于5 μmol/L ATX+照射組與20 μmol/L ATX+照射組，而Caspase-3表達(dá)明顯低于5 μmol/L ATX+照射組與20 μmol/L ATX+照射組(均P<0.05)；且20 μmol/L ATX+照射組Bcl-2、Bax表達(dá)水平明顯低于5 μmol/L ATX+照射組，而Caspase-3表達(dá)水平明顯高于5 μmol/L ATX+照射組(均P<0.05)，見(jiàn)圖2，表1。

1～6：未照射對(duì)照組，未照射+5 μmol/L ATX組，未照射+20 μmol/L ATX組，照射對(duì)照組，5 μmol/L ATX+照射組，20 μmol/L+ATX+照射組圖2 ATX調(diào)節(jié)U251細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)

表1 Western印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax和Caspase3的蛋白表達(dá)

3 討 論

放射治療是腦膠質(zhì)瘤治療的重要組成部分，治療技術(shù)和治療策略已得到了明顯改善，但晚期腦膠質(zhì)瘤患者放療預(yù)后仍然非常差，5年存活率為30%～35%〔9〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤放療失敗的部分原因歸于放療抵抗導(dǎo)致的腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)〔2〕。因此，發(fā)現(xiàn)一種新型高效低毒放療增敏劑以提高腦膠質(zhì)瘤的放射敏感性和提高腦膠質(zhì)瘤預(yù)后具有十分重要的意義。ATX屬于葉黃素家族，具有抗氧化，抗腫瘤，抗炎和保護(hù)心臟的作用，對(duì)人類具有潛在的益處〔17〕。越來(lái)越多的研究表明，ATX作為一種有前景的治療方法，可調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展中的幾種生理反應(yīng)〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，ATX可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κBp65和Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制人肝癌細(xì)胞系LM3和SMMC-7721的生長(zhǎng)〔18〕。盡管ATX對(duì)人類腫瘤的作用已被廣泛研究，但ATX在腦膠質(zhì)瘤放療中的作用研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)ATX在腦膠質(zhì)瘤治療中潛在的放射增敏作用及其初步作用機(jī)制進(jìn)行了研究。我們通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給與ATX可降低IR后U251細(xì)胞的克隆形成能力，且隨劑量增大其增敏效果越明顯。本研究表明ATX對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞具有放射增敏作用，且隨著藥物劑量的增加，其放射增敏效果增強(qiáng)。研究證實(shí)，細(xì)胞放射敏感性同細(xì)胞凋亡率密切相關(guān)，細(xì)胞照后凋亡率越高，其放射敏感性越強(qiáng)〔19〕。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此呼應(yīng)，通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)凋亡通路關(guān)鍵分子的表達(dá)與活化發(fā)現(xiàn)，ATX可抑制U251細(xì)胞的抗凋亡因子Bcl-2及Bax的表達(dá)，促進(jìn)凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的活化，從而有效地啟動(dòng)凋亡途徑，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該細(xì)胞照射之后生存率、克隆形成能力的調(diào)控。此外，相關(guān)研究提示由于腫瘤細(xì)胞c-myc癌基因表達(dá)被抑制，引起了腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑被下調(diào)，從而增強(qiáng)了其對(duì)放化療的治療抗性〔20〕，而ATX正是通過(guò)提高其凋亡途徑達(dá)到消除放療抵抗的目的，從而從理論上印證了ATX作為新型放療增敏劑的開(kāi)發(fā)前景。綜上所述，蝦青素對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有十分明確的放射增敏作用，且該作用強(qiáng)弱與ATX的濃度間存在者一定的劑量相關(guān)性。此外，ATX的這種放射增敏性是通過(guò)增強(qiáng)U251細(xì)胞的凋亡通路而實(shí)現(xiàn)的，部分解釋了其作用機(jī)制。然而，限于本研究的深度，ATX對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療增敏作用的臨床應(yīng)用潛力及具體分子機(jī)制仍有待完善。