miR-23a-3p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型的功能機(jī)制

黃景賀 賈賀 李富慧 陳艷芳

(1南陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473000；2鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年病科)

帕金森病是老年人群中常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，其主要特點(diǎn)為發(fā)病率高及起因隱匿且已嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，但關(guān)于帕金森病發(fā)病原因尚未完全闡明〔1〕。既往研究顯示神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是引起帕金森病的重要原因〔2〕。因而通過(guò)保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞可有效干預(yù)帕金森病發(fā)生及發(fā)展。微小RNA(miRNA)普遍存在于多種生物體內(nèi)，并可通過(guò)靶向結(jié)合下游靶基因進(jìn)而調(diào)控靶蛋白轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程，已有研究表明miRNA在帕金森病等多種疾病中異常表達(dá)并可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過(guò)程進(jìn)而參與疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔3，4〕。研究表明miRNA-23a-3p在多種疾病中表達(dá)均異常降低，并可參與炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)展、心臟病變等多種疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔5〕。實(shí)驗(yàn)創(chuàng)傷性腦損傷后miR-23a-3p表達(dá)量的下調(diào)并可誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞死亡〔6〕。α突觸核蛋白基因(SNCA)的3′UTR區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)的突變誘發(fā)SNCA表達(dá)量增高進(jìn)而促使帕金森病發(fā)生及發(fā)展，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未完全闡明〔7〕。因而針對(duì)SNCA作用機(jī)制的進(jìn)一步研究有助于闡明帕金森病的機(jī)制及尋找更好的治療方法。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)顯示SNCA可能是miR-23a-3p的靶基因，本研究旨在探討miRNA-23a-3p對(duì)1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)帕金森病細(xì)胞模型增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；miR-23a-3p mimics及其陰性對(duì)照miR-con均購(gòu)自廣州銳博生物科技公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑與Trizol試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自北京天根生物科技公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；兔抗人SNCA抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自滅國(guó)Promega公司；活性氧(ROS)與LDH檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 SH-SY5Y細(xì)胞種植于RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到85%左右時(shí)，使用不同濃度(0、1、2、4 mmol/L)的MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h，觀察細(xì)胞存活率并篩選適宜MPP+濃度〔8〕。收集SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后棄培養(yǎng)液，使用濃度為4 mmol/L的MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞后接種于6孔板，將未經(jīng)MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞命名為control組，同時(shí)待細(xì)胞融合度達(dá)到50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別將miR-23a-3p mimics及miR-con分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別為MPP++miR-23a-3p組、MPP++miR-con組，另分別將miR-23a-3p mimics與pcDNA-control、miR-23a-3p mimics與pcDNA-SNCA共轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別為MPP++miR-23a-3p+pcDNA-control組、MPP++miR-23a-3p+pcDNA-SNCA組。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-23a-3p、SNCA mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組SH-SY5Y細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次，40個(gè)循環(huán)(95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s)，miR-23a-3p以U6為內(nèi)參，SNCA以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-23a-3p、SNCA mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活性 分別收集各組SH-SY5Y細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，SH-SY5Y細(xì)胞接種至96孔板(5×103個(gè)/孔)，每孔分別加入10 μl CCK-8溶液，充分振蕩混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)為450 nm處的相對(duì)吸光度值(OD)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，收集各組SH-SY5Y細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞3次×5 min，加入500 μl上樣緩沖液懸浮細(xì)胞，室溫下加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，充分混勻，避光孵育15 min后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況。

1.6Western印跡檢測(cè)SNCA、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度，分別加入5×蛋白上樣緩沖液，放入沸水中變性10 min，取30 μg蛋白樣本上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應(yīng)分離蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下使用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h，TBST洗膜3次×10 min，孵育一抗(1∶1 000)，4℃孵育24 h，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次×10 min，滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，放入化學(xué)發(fā)光成像儀成像，應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-23a-3p靶基因 利用starBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-23a-3p的靶基因SNCA的3′UTR序列，構(gòu)建SNCA的3′UTR野生型質(zhì)粒SNCA(WT)，構(gòu)建SNCA的3′UTR突變位點(diǎn)質(zhì)粒SNCA(MUT)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞分別接種于24孔板，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染SNCA(WT)與miR-23a-3p mimics或miR-con，培養(yǎng)48 h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.8檢測(cè)細(xì)胞ROS水平及LDH含量 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞，按照每孔5×103個(gè)細(xì)胞/ml的密度將其接種于96孔板，按照ROS水平檢測(cè)試劑盒與LDH含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平及LDH活力。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MPP+對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的細(xì)胞活性及miR-23a-3p表達(dá)的影響 與0 mmol/L MPP+組相比，2 mmol/L MPP+組、4 mmol/L MPP+組SH-SY5Y細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.05)，miR-23a-3p表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取4 mmol/L MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞。

表1 不同濃度MPP+處理對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活性及miR-23a-3p表達(dá)量的影響

2.2miR-23a-3p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活性及細(xì)胞毒性的影響 與control組相比，MPP+組SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平及LDH含量均顯著升高(P<0.05)，相對(duì)于MPP++miR-con組，MPP++miR-23a-3p組SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，而ROS水平及LDH含量均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 miR-23a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活性及細(xì)胞毒性的影響

2.3miR-23a-3p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 與control組相比，MPP+組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；相對(duì)于MPP++miR-con組，MPP++miR-23a-3p組SH-SY5Y凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖1、圖2。

1～4:control組、MPP+組、MMP++miR-con組、MMP++miR-23a-3p組圖1 miR-23a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 miR-23a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

2.4miR-23a-3p靶向SNCA-3′-UTR，抑制SNCA的表達(dá) starBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示SNCA-3′-UTR存在與miR-23a-3p結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。與miR-con相比，miR-23a-3p組SNCA(WT)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；SNCA(MUT)熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)。表明miR-23a-3p可靶向結(jié)合SNCA。與miR-con組 相比，miR-23a-3p組細(xì)胞中SNCA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表3。

圖3 miR-23a-3p與SNCA的3′UTR結(jié)合位點(diǎn)

圖4 Western blot檢測(cè)miR-23a-3p的表達(dá)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞中SNCA蛋白表達(dá)的影響

表3 雙熒光素酶活性檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中miR-23a-3p與SNCA的靶向關(guān)系

2.5SNCA過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-23a-3p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活性及細(xì)胞毒性的影響 與MPP++miR-23a-3p+pcDNA-control組相比，MPP++miR-23a-3p+pcDNA-SNCA組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，ROS水平與LDH含量均顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.6SNCA過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-23a-3p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 與MPP++miR-23a-3p+pcDNA-control組相比，MPP++miR-23a-3p+pcDNA-SNCA組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖5。

表4 miR-23a-3p與SNCA過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活性及細(xì)胞毒性的影響

1～4：MMP++miR-con組、MMP++miR-23a-3p組、MMP++miR-23a-3p+pcDNA-control組、MMP++miR-23a-3p+pcDNA-SNCA組圖5 Western印跡檢測(cè)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量

3 討 論

帕金森病主要特征為基底神經(jīng)節(jié)中腦黑質(zhì)致密部位多巴胺神經(jīng)元退化、進(jìn)行性缺失，既往研究顯示帕金森病與遺傳易感性、炎癥、氧化應(yīng)激等引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)〔9〕。研究表明miRNA表達(dá)異常可參與帕金森病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔10〕。因此，本研究積極探尋新型miRNA及其在帕金森病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，為提高臨床治療效果及患者生活質(zhì)量提供新策略。

miR-23a-3p在白血病細(xì)胞中表達(dá)升高，抑制miR-23a-3p表達(dá)可明顯抑制白血病細(xì)胞遷移及侵襲〔11〕。研究表明動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中患者血漿中miR-23a-3p的表達(dá)水平顯著降低，并可能參與該疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔12〕。miR-23a表達(dá)異常與急性炎癥反應(yīng)、免疫功能損傷及心肌梗死等密切相關(guān)〔13，14〕。本研究結(jié)果顯示，MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞活性顯著降低，miR-23a-3p表達(dá)水平亦顯著降低，上調(diào)miR-23a-3p表達(dá)可明顯促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞增殖，并可降低ROS水平及LDH活力。研究表明ROS水平及LDH活力升高可促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，通過(guò)抑制ROS產(chǎn)生及LDH活性可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力〔15，16〕。提示上調(diào)miR-23a-3p表達(dá)可通過(guò)增強(qiáng)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力進(jìn)而保護(hù)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率顯著增加，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)miR-23a-3p表達(dá)后細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，研究表明通過(guò)提高Bcl-2蛋白表達(dá)及抑制Bax表達(dá)可抑制帕金森病模型大鼠腦黑質(zhì)細(xì)胞凋亡進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞〔17〕。提示上調(diào)miR-23a-3p表達(dá)可通過(guò)提高Bcl-2蛋白表達(dá)及抑制Bax表達(dá)進(jìn)而對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。

SNCA基因突變及其多態(tài)性與帕金森病發(fā)生密切相關(guān)〔18，19〕。SNCA表達(dá)升高可引起α-synuclein蛋白的異常聚集進(jìn)而促進(jìn)帕金森病患者嗜酸性包涵體形成〔20〕。本研究通過(guò)預(yù)測(cè)miR-23a-3p靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNCA可能是miR-23a-3p的靶基因，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示SNCA是miR-23a-3p的靶基因，miR-23a-3p可負(fù)向調(diào)控SNCA的表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示SNCA過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-23a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活性的促進(jìn)作用及細(xì)胞毒性的抑制作用，并可逆轉(zhuǎn)miR-23a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的抑制作用。提示MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中提高miR-23a-3p表達(dá)可能作為治療帕金森病的新方向。綜上所述，miR-23a-3p在帕金森病細(xì)胞模型中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-23a-3p表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞凋亡，其可能通過(guò)靶向抑制SNCA表達(dá)而對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，有助于提高臨床治療帕金森病的治療效果，可為帕金森病基因治療提供新方向。