一種同時測定生鮮乳中7種巴比妥類藥物的方法及其應用效果

楊曉君 梅博 韓奕奕

（上海市農產品質量安全中心，上海 201708）

巴比妥類藥物（barbiturates）是一種安眠鎮靜藥物，通常作為化學保定劑和鎮靜藥物用于動物臨床，可引起近似生理性睡眠，臨床表現主要為抑制中樞神經系統（包括血管運動中樞和延腦呼吸中樞）[1]。但是，由于巴比妥類藥物存在致癌、致畸等毒性作用，長時間食用帶有其殘留的動物制品，容易造成藥物積累，嚴重危害人類健康。因此，許多國家和地區禁止將巴比妥類藥物用于人和動物[2-3]。據文獻報道，目前，分析巴比妥類藥物的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質譜聯用法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法等。其中，高效液相色譜-質譜聯用法是目前巴比妥類藥物檢測的首選方法，其應用范圍廣泛。例如，張峰[4]等建立了超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜快速檢測方法，并對動物飼料中違禁添加的巴比妥類藥物進行了測定，樣品經甲醇提取、C18固相萃取柱凈化后進行檢測，3種化合物的檢出限為0.20 mg/kg，回收率為62%～85%；田懷香[5]等采用高效液相色譜-串聯質譜法檢測了生鮮乳中4種巴比妥類藥物殘留，樣品經乙腈提取、SPE柱凈化后進行檢測，4種藥物殘留的檢出限為5 ng/g，回收率為85.0%～113.5%。

筆者分析已有的研究成果發現，國內外報道的巴比妥類藥物檢測方法大多是針對人的血液、尿、胃內容物和豬肉、豬肝中的藥物殘留及其代謝產物，目前，將此方法應用到生鮮乳中巴比妥類藥物殘留檢測的研究較少。因此，建立一種生鮮乳中巴比妥類藥物殘留的檢測方法，具有極其重要的意義，不僅能健全和完善相關的標準體系，還可規范原奶的生產技術，從而促進生鮮乳行業整體質量水平的提高。在此背景下，筆者研發了一種能快速、靈敏、特異性強地檢測生鮮乳中7種巴比妥類藥物（巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥和硫噴妥）的方法，并對該方法所涉及的提取、凈化、定性條件、定量條件等進行了優化，以期加強生鮮乳行業質量監控，切實保護奶農和消費者的利益。現將相關研究成果報道如下。

1 材料與方法

1.1 化學藥品和試劑

化學藥品和試劑包括：乙腈、甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司），超純水（Milli-Q系統生產），PSA吸附劑（天津博納艾杰爾科技有限公司），無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉（分析純，德國M e r c k默克)，巴比妥（Barbital）、苯巴比妥（Phenobarbital）、戊巴比妥（Pentobarbitone）、異戊巴比妥（Amobarbital）、仲丁比妥（Butabarbital）、司可比妥（Secobarbital）、硫噴妥（Pentothal）的標準品純度不低于95%（天津阿爾塔科技有限公司）。

標準貯備液制備：準確移取巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥、硫噴妥的標準品各1.00 mL，分別用甲醇定容至10.00 mL，配制成濃度為10 μg/mL的標準貯備液，然后在2～8 ℃的環境下冷藏保存，有效期為3個月。

混合標準中間液制備：準確移取巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥、硫噴妥的貯備液各1 mL，用甲醇定容至10.00 mL，該混合溶液中巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥、硫噴妥的濃度均為1 μg/mL，在2～8 ℃環境下冷藏保存，有效期為1個月。

1.2 儀器和條件

Agilent 6495 三重四極桿液質聯用系統（美國Agilent公司），ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱（規格為150 mm×3.0 mm，粒徑1.8 μm，美國Agilent公司）。

液相色譜條件：柱溫為35 ℃；進樣體積為5μL；流速為0.4 mL/min；A路流動相為水，B路流動相為乙腈，流速及梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

質譜檢測條件：離子源為電噴霧離子源（ESI）；毛細管電壓為3.5 kV；噴嘴電壓為500 V；干燥氣溫度為200 ℃；鞘氣溫度為250 ℃；掃描方式為負離子掃描；檢測方法為多重反應監測（MRM）；干燥氣流量為14 L/min；鞘氣流量為11 L/min；霧化器工作壓力為35 psi；定性離子對、定量離子對、碰撞能量加速電壓參數均見表2。

表2 7種巴比妥類藥物的質譜檢測條件和保留時間

1.3 實驗方法

經對檢測方法所涉及的提取、凈化、定性條件、定量條件等進行優化（優化結果見2.1），得到最終檢測方法如下。

1.3.1 樣品前處理

提取：準確稱取生鮮乳樣品10.00 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入乙腈20 mL，高速渦旋混勻20 min，然后加入6 g復合沉淀劑（無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉按質量比8∶2∶2∶1混合而成），立即渦旋混勻約30 s，于8 000 rpm條件下離心10 min，取上清液備用。

凈化：吸取提取液約8 mL于已加入1 g復合吸附劑（無水硫酸鎂、PSA按質量比6∶1混合而成）的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻30 s后，于10 000 r/min條件下離心5 min。取上清液于eppendorf管內，用水定容至1 mL，充分混勻后經0.22 μm有機相濾膜過濾，供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.2 標準溶液的制備

將空白樣品按樣品提取步驟進行前處理，取巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、仲丁比妥、司可比妥、硫噴妥標準溶液,用空白樣品提取液分別配成2、5、10、20、50、100 ng/mL的基質混合標準工作溶液，供上機測定。

1.3.3 數據分析

使用Excel軟件對實驗數據進行分析處理，顯著性為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 檢測方法優化

2.1.1 提取試劑優化

本實驗比較了甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙腈4種提取試劑的提取效果。結果發現，甲醇對蛋白的沉淀效果不好；乙酸乙酯和三氯甲烷雖能較好地提取極性較弱的巴比妥類藥物，但是由于生鮮乳中的脂肪、蛋白、磷脂含量較高，導致提取過程中容易產生乳化現象；乙腈不僅能完全提取生鮮乳中的巴比妥類藥物，還能起到較好的沉淀蛋白作用，且在酸性條件下，在乙腈溶液中再加入氯化鈉、硫酸鎂等沉淀劑，可通過增加水相比重，有效將巴比妥類藥物全部轉移到乙腈層。因此，本實驗選擇乙腈作為提取試劑。

2.1.2 固相吸附劑優化

本實驗比較了不凈化、活性炭凈化、C18凈化、普通凈化的凈化效果，4種固相吸附劑的組分見表3。結果發現，以普通的無水硫酸鎂+PSA組合的凈化效果最好，回收率最高，結果見圖1。

表3 4種固相吸附劑組分比較

圖1 不同凈化方式的巴比妥類藥物回收率

2.1.3 液相色譜柱的選擇和洗脫程序優化

本實驗比較了以甲醇-水和乙腈-水為流動相時7種巴比妥類藥物的質譜響應。結果發現，以乙腈-水為流動相時，7種巴比妥類藥物的質譜響應更好，故本實驗采用乙腈作為流動相中的有機相。同時，本實驗還比較了以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相時7種巴比妥類藥物的離子對信號強度的影響，結果表明，當水相中加入0.1%甲酸時，僅有硫噴妥的離子對信號強度增強，其他6種巴比妥類藥物的離子對信號強度均減弱，故最終本實驗選擇乙腈-水作為流動相進行試驗。

巴比妥類藥物殘留檢測中常用的色譜柱有C18和HSS PFP色譜柱，本實驗以水-乙腈為流動相，比較了7種巴比妥類藥物在兩種色譜柱上的分離效果。結果發現，7種巴比妥類藥物在C18柱上的峰形、響應信號明顯優于HSS PFP色譜柱，見圖2。故本實驗選擇C18液相色譜柱進行試驗。同時，本實驗還發現，柱溫會影響待測物的保留時間和峰型，表現為柱溫越高，出峰越快，保留時間越小，且峰型變窄，分離度增大。為滿足檢測條件，最終本實驗選擇柱溫為35 ℃。

圖2 7種巴比妥類藥物總離子流圖

2.2 方法驗證

筆者對優化形成的同時檢測生鮮乳中7種巴比妥類藥物的高效液相色譜-串聯質譜法的線性關系、準確度、精密度進行驗證。

2.2.1 線性關系和檢出限

在2～100 ng/mL濃度范圍，7種巴比妥類藥物的相關系數均大于0.995 0，表現出良好的線性關系。同時，在樣品中添加最低檢出限相當濃度的標樣，以驗證該方法的靈敏度，發現該方法對生乳中巴比妥類藥物的檢出限為10 μg/kg，方法靈敏度高，可用于痕量分析。具體結果見表4。

表4 線性關系、檢出限、相關系數和濃度范圍

2.2.2 準確度、精密度

在樣品添加濃度為20～100 ng/mL時，巴比妥的回收率為81.2%～95.9%，苯巴比妥的回收率為81.9%～94.3%，仲丁比妥的回收率為88.6%～96.3%，戊巴比妥的回收率為93.2%～99.2%，異戊巴比妥的回收率為89.0%～99.5%，司可比妥的回收率為93.1%～98.2%，硫噴妥的回收率在79.9%～82.1%，表明該方法可實現較高的回收率，滿足檢測要求。見表5。

表5 7種巴比妥類藥物殘留的加標回收準確度實驗結果

在樣品添加濃度為20 ng/mL時進行重復性試驗，巴比妥的變異系數為3.11%，苯巴比妥的變異系數為3.58%，仲丁比妥的變異系數為2.86%，戊巴比妥的變異系數為4.28%，異戊巴比妥的變異系數為3.07%，司可比妥的變異系數為4.41%，硫噴妥的變異系數為4.27%，表明該方法具有較好的重復性和穩定性。見表6。

表6 7種巴比妥類藥物殘留的加標回收精密度實驗結果

根據方法學驗證的要求，組織上海市食品研究所、上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所、上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心等單位對本方法進行驗證試驗，并對生鮮乳中7種巴比妥類藥物的殘留量進行再現性試驗。結果表明，重復性變異系數在2.56%～4.55%，再現性變異系數在 2.87%～4.69%。

結合上海市農產品質量安全中心生鮮乳質量安全與日常保障項目，收集來自上海及其周邊地區牧場的生鮮乳樣品98批次，運用該方法進行7種巴比妥類藥物殘留的風險排查工作。經檢測，98批次生鮮乳樣品中均未檢出巴比妥類藥物殘留，且試驗過程中加標質控樣的回收率在80.4%～95.6%。以上結果說明，上海及其周邊地區的牧場在奶牛生產養殖過程中，嚴格遵守了國家相關法規，均沒有違禁使用巴比妥類藥物。

3 結論與討論

筆者研發了一種能快速、靈敏、特異性強地檢測生鮮乳中7種巴比妥類藥物（巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥和硫噴妥）的高效液相色譜-串聯質譜法，該方法具有較好的靈敏度、選擇性和穩定性，此方法檢出限為10 μg/kg，回收率為79.9%～99.5%，回收率試驗變異系數≤7.58%，重復性試驗變異系數≤4.41%。同時，本方法采用QuEChERS前處理技術，相較于傳統凈化過柱方法，縮短了60%以上的操作時間，可做到批量測定。因此，該方法具有較好的應用前景。

值得注意的是，該方法中前處理樣品的稀釋倍數較高，因此宜適當降低稀釋倍數，并提高上機液濃度，從而提高該方法的靈敏度，以適應更低濃度的精確定量要求。