細胞內的翻譯后易位研究進展

王圣巖

（福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117）

研究中最早發現的內質網易位方式是依靠信號識別顆粒（signal recognition particle,SRP）的共翻譯易位（co-translational translocation）。在共翻譯易位中，蛋白先在核糖體上翻譯出信號序列，通過信號序列的疏水性與細胞質中的SRP結合，翻譯暫停。SRP牽引核糖體蛋白質復合物向內質網轉移，并與內質網膜上的SRP受體結合，核糖體結合在Sec61上，翻譯繼續，最終將蛋白質引導至Sec61通道中[1-4]。在酵母中的研究發現，共翻譯易位方式只占了全部分泌蛋白的43.3%；還有56.7%的蛋白運輸并不依靠SRP[5]，比如錨定蛋白和比較短的分泌蛋白則需要另一種途徑完成轉運，即翻譯后易位（posttranslational translocation）途徑。參與翻譯后易位的蛋白其信號序列疏水性不足或長度不夠，不能被細胞質中的SRP識別，所以它們需要另一種分子伴侶引導蛋白定位到內質網上。在真核生物中，分泌蛋白向內質網轉運是蛋白質分泌初始階段的關鍵步驟，如果這個過程出現錯誤，蛋白質穩定會被破壞甚至導致細胞功能障礙[6]。為了更好地了解翻譯后易位，本文對翻譯后易位的相關機制進行了綜述，同時也描述了Sec復合物的結構和功能。

1 翻譯后易位途徑

分泌蛋白質是生物體進行生命活動的重要組成部分，而這些蛋白質想要發揮功能就需要進入內質網進行進一步加工。根據進入內質網方式的不同，轉運方式分為共翻譯易位和翻譯后易位。這兩種方式的區別主要體現在蛋白質翻譯的時機和靶向內質網方式的不同。真核生物中細胞器被膜分隔成獨立的區域，蛋白質前體合成后需要進入內質網加工。由于內質網膜的存在，從細胞質進入內質網需要有分泌信號通路（general secreation pathway,Sec）的參與，進而再運輸到特定的區域發揮功能，這就需要蛋白質在轉運過程中精準靶向[6]。翻譯后易位途徑可分為三個步驟：第一步是多肽鏈在細胞質中通過核糖體完成合成，然后細胞質中的分子伴侶結合到多肽鏈上將其引導至內質網膜上；第二步是多肽鏈N短的信號序列進入Sec通道，在其它Sec蛋白的幫助下通道擴大，信號序列在通道內切割并從通道側面釋放；第三步是通過內質網內部的分子伴侶將多肽鏈拉入到內質網里面進行加工折疊[7]（圖1）。

圖1 翻譯后易位途徑

2 翻譯后易位復合物組成和結構

翻譯后易位機制復雜，需要內質網膜上多種復合物及細胞質中和內質網腔內分子伴侶的參與。在翻譯后易位過程中，分泌蛋白依然是通過Sec61通道進入內質網，但額外需要Sec62-Sec63復合物的輔助。酵母內質網膜上Sec復合物組成如圖1所示，這些復合物相互作用，共同完成翻譯后易位過程。翻譯后易位復合物在酵母、人和小鼠中名稱有所差別（表1）。

表1 參與翻譯后易位的Sec復合物

Sec61 復合物是蛋白質轉運機制中的關鍵元件，形成一個內部疏水的蛋白質轉運通道[8]。Sec61轉運通道由三個亞基構成，分別是Sec61p、Sss1和Sbh1。Sec61p是最主要的亞基，也是最大的亞基，它包含十個跨膜螺旋（transmembrane helices,TM），呈沙漏狀，多肽就是通過這個通道轉運到內質網內[9]。Sec61p有兩個較大的環L6和L8，它們位于細胞質面，是在共翻譯易位期間核糖體的結合位點。Sss1和Sbh1體積較小，附著在Sec61p周圍并與之產生聯系。在閑置狀態下，轉運通道被一個閥塞結構域堵住，這個結構域由第一個跨膜螺旋（TM1）之后的片段形成，在蛋白質開始易位時這個結構會移開，從而使通道打開[10-12]。這個通道還包含一個側門（lateral gate），由TM2和TM7構成，可以將多肽釋放到脂質相中，并且信號序列被切割之后將從此處被釋放[9]，側門的打開是可溶性分泌蛋白疏水性信號序列的識別和跨膜蛋白整合所必需的。Sec61p開放與關閉狀態下的結構已被解析，具體結構特征可參考Voorhees等人的研究工作[10]。

Sec62 由一個球狀的N末端、C末端和兩個跨膜螺旋（TM1、TM2）組成，N末端和C末端均位于細胞質中，兩個跨膜螺旋被內質網腔內一個短的環連接，Sec62整體結構呈現“V”字型[9]。Sec62與Sec61p主要是以Sec62-TM1和Sec61p-TM3、N末端接觸。在Sec62-TM2之后存在一個平躺在膜上的橢圓形結構域，稱為錨定區域。這個區域富含疏水性，在釀酒酵母中對其中疏水性殘基進行單點突變不會導致生長缺陷，但在215-220位中進行三個連續的突變就會致死，說明疏水性的降低會終止其與內質網膜的相互作用，這個錨定區域的功能是將Sec62正確定位在Sec61上[9]。

Sec63 由三個跨膜結構域構成，在細胞質面有一個FN3結構域并且在內質網腔內含有一個J結構域[13]。與Sec63緊密相關的Sec71（也被稱為Sec66、Hss1）和Sec72（也被稱為Sec67、Sim2）最初是從調節膜蛋白轉位缺陷的酵母遺傳機制中篩選出來的[14]。Sec71是一種單跨膜蛋白，含有三個α螺旋其中兩個在N末端構成Sec71的底部，C末端帶有一個胞質結構域。Sec72是一種外周膜蛋白，由一個帶有TPR（tetratricopeptide repeat）結構域的C末端和一個于Sec71相互作用的N末端結構與構成[15-17]。這兩個亞基通常以Sec71-Sec72復合體出現， Sec71整合到Sec復合物上需要Sec72的存在，而Sec71又對Sec72在體內的穩定性至關重要[15]。Sec71-Sec72復合體僅由各自的一條肽鏈進行連接，在Sec71中只需要胞質端的結構域就可滿足連接的需要[17]。此外，TPR結構域會與細胞質中的分子伴侶Ssa1和Ssb1相互作用，分別將翻譯后易位蛋白和共翻譯易位蛋白募集到Sec71-Sec72復合物上[17]。

3 翻譯后易位的調控機制

參與翻譯后易位的蛋白主要是錨定蛋白和分泌蛋白。錨定蛋白帶有一個疏水性的跨膜區，跨膜區會引導蛋白向內質網定位[18]。最早被發現的與錨定蛋白翻譯后易位相關的細胞質因子是信號識別顆粒，所以有可能存在一種與共翻譯途徑相關的翻譯后SRP依賴性轉位途徑[6]。分泌蛋白，例如酵母中的PpαF能夠有效的證明翻譯后易位的存在[19,20]。分泌蛋白的信號序列沒有足夠的疏水性來與SRP進行有效的結合[21]，所以在轉位的過程中需要細胞質中的分子伴侶來促進蛋白的易位，例如酵母中的Hsp (heat shock protein)70、Hsp40等。Hsp70并不是單獨發揮功能，而是需要各種輔助因子，例如J-蛋白（Hsp40），J-蛋白會與未折疊的蛋白進行初步結合并將其傳遞到Hsp70[22]，進而防止蛋白折疊和聚集。Hsp70中有一個Ssa1蛋白與翻譯后易位相關，其可以通過C末端與Sec72的TRP結構域相互作用[17]，翻譯后易位蛋白便可以通過Ssa1到達內質網膜。

在翻譯后易位的初始階段，多肽N端進入Sec61復合物的易位通道，N端的信號序列必須與信號肽酶結合被切割分離，但翻譯后易位信號序列被切割的時機仍不清楚。Sec62有時會在信號序列切割的環節中造成一些影響，比如它會阻止信號序列從易位通道側門的釋放或者阻止信號肽酶對與切割位點的結合，正常情況下Sec62-TM2與Sec61-TM7會改變原來的構象，兩者之間產生空隙從而釋放被切割的信號序列[9]。同時，Sec62可以形成一道屏障來防止脂質通過打開的通道側門滲透到易位通道的內部，脂質的滲透可能會通過競爭性抑制多肽進入通道從而影響蛋白質易位[9]。近二十年的一些研究中發現了Sec62在翻譯后易位中的作用，但Sec62在蛋白質易位過程中的詳細功能仍然是不能完全確定的，Lakkaraju等人發現由不多于100個氨基酸組成和部分由120-160個氨基酸組成的翻譯后易位蛋白的前體會依賴Sec62進行有效轉運[23]。在Lang等人的一項研究中，Sec62的沉默會導致小的分泌蛋白通過翻譯后易位進入內質網的效率降低，但不會影響共翻譯易位和錨定蛋白翻譯后易位膜插入的能力[24]。

多肽鏈的進入Sec61通道后，內質網內的分子伴侶，如BiP，可以起到引導作用，保證新生蛋白質通過易位通道單向運輸到內質網腔中。為了促進這些分子伴侶與轉運中的多肽鏈之間的相互作用，Sec63的J結構域介導了它們之間的相互作用。有研究證明，Sec63與BiP的相互作用在某些易位蛋白質運輸的早期階段可以有效促進其進入Sec61通道[25,26]，但并不適用于全部蛋白，所以Sec63在轉運機制中的特異性還有待研究[14]。

無論是在體內還是體外，Sec62和Sec63的突變對不依賴于SRP的翻譯后易位蛋白的轉運有影響，而對依賴SRP轉運的共翻譯易位并無影響，說明了蛋白質的轉運方式是由信號序列影響的[13]。在翻譯后易位中，Sec62-Sec63復合物與Sec61復合物的相互作用會使得通道側門的開口更大[27,28]，而共翻譯易位中核糖體打開的側門開口會小的多[28,29]。Sec63位于Sec61通道側門的對面，與通道側門的開放程度有關，Sec63敲除之后側門開口會縮小，雖然Sbh1也處于側門附近，但它對開口的影響不大[13]。Sec63不僅能打開側門還可以激活Sec61通道進行易位，最近的一項研究也為真核生物中Sec62和Sec63如何激活Sec61通道進行翻譯后蛋白質易位提供了一個比較詳細的研究模型[9]。Sec63通過兩個部分與Sec61接觸：一個是通過Sec61-TM3固定在Sec61復合物上；另一個是通過TM3附近在內質網中的短片段和Sec63N末端與Sec61通道相互作用[9]。Sec63是通過細胞質和內質網中結構域的雙重作用下打開Sec61側門的。Sec62可以激活Sec61通道，但其與處于關閉狀態下的側門的結構是不兼容的，所以在Sec62激活蛋白質易位通道之前必須先由Sec63將側門打開[9]。

Sec72 與細胞質中的分子伴侶 Ssa1、Ssb1在蛋白質易位中發生作用，無論共翻譯易位蛋白還是翻譯后易位蛋白都會被募集到Sec71-Sec72復合體上，這改變了之前認為只有共翻譯易位才存在靶向過程的認知，說明了熱休克蛋白分子不僅僅是讓多肽保持未折疊狀態，且能夠對翻譯后易位蛋白進行靶向[30,31]。在翻譯后易位中由Hsp70與免疫球蛋白BiP（酵母中稱為Kar2）提供多肽鏈的易位動力，BiP被認為是通過與肽鏈的結合來催化蛋白質通過Sec61通道，并且能夠防止多肽鏈反向移動到細胞質中[32]。

4 未來與展望

在對翻譯后易位的研究中揭示了蛋白質向內質網易位的復雜過程，這個過程需要細胞質因子、內質網膜蛋白和內質網腔內分子伴侶的共同作用。對翻譯后易位的研究具有重大意義，尤其是在外源蛋白表達系統中，隨著翻譯后易位途徑的調控機制被揭示，外源蛋白表達系統對分泌蛋白的表達量或許可以高出原來的幾倍，這無疑是外源蛋白表達系統的一個巨大潛力。但目前對翻譯后易位的分子機理的研究還不夠全面，在蛋白質易位的過程中或許還涉及其他尚未發現的成分。Sec復合物對生命體是不可或缺的，但其每一步構象變化的時機和識別機制還有待充分探索。