CRISPR-Cas9篩選系統在病毒宿主作用因子鑒定中的優勢

董海麗

（福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117）

病毒依靠宿主細胞完成其復制周期，它們利用宿主細胞膜表面受體及胞內輔助因子進入細胞并且利用宿主細胞代謝進行其基因組的復制，組裝子代病毒體并傳播。為了治療和預防病毒感染，研究人員進行了基因篩查，而CRISPR-Cas系統正成為基因篩查中必不可少的工具。CRISPR-Cas系統應用廣泛，是一種分子診斷工具，可用于功能性缺失的基因篩查。CRISPR-Cas9介導的基因組修飾可激活或抑制基因表達，并且有標記特定基因組位點的功能區域，從而準確編輯基因組[2]。目前，CRISPR-Cas9系統的特異性與可重復性使其成為一種認可度較高的基因編輯工具。近幾年，CRISPR-Cas9全基因組編輯后的篩選系統已應用于病毒受體及其所需的宿主胞內輔助因子的鑒定，包括臨床相關病毒受體，例如丙型肝炎病毒（HCV）受體、登革熱病毒（DENV）受體[3]、寨卡病毒（ZIKV）受體、西尼羅河病毒（WNV）受體等[4]；也包括病毒入侵宿主細胞所需的胞內輔助因子，例如甲型流感病毒（IAV）入侵的輔助因子capicua（CIC）和人類免疫缺陷病毒（HIV）入侵的輔助因子酪氨酰蛋白質磺基轉移酶2（TPST2）與溶質載體家族成員B2（SLC35B2）等[5]。

本文介紹了CRISPR-Cas9系統的應用，該系統能進行全基因組規模的敲除，篩選受體及胞內輔助因子，并且將CRISPR-Cas9系統篩選與單倍體細胞篩選（Haploid），酵母雙雜交系統篩選，RNA干擾（RNAi）等其他遺傳篩選技術進行比較，以增進我們對篩選技術的認識和優化相應的篩選方案。

1 CRISPR-Cas9 全基因組敲除系統

CRISPR-Cas9 系統是細菌和古細菌中進化出的適應性免疫防御系統，包括tracrRNA，crRNA 和Cas9蛋白。在三者共同介導下，發揮CRISPR-Cas9的靶向切割作用，該過程由三個不同階段組成：識別、表達和切割，如圖1。

圖1 CRISPR-Cas9系統抵御外源核酸入侵宿主細胞

在識別階段，外來核酸作為新的CRISPR間隔區定向整合到由重復序列分隔的CRISPR陣列中，從而產生入侵元件的遺傳記憶。在表達階段，CRISPR陣列轉錄成pre-crRNA，隨后加工成包含間隔區序列與重復序列連接的成熟crRNA。在干擾階段，crRNA通過互補的重復序列與tracrRNA結合形成復合物稱為向導RNA（sgRNA），它引導Cas9核酸酶靶向切割外源入侵的DNA序列[6]。因此，CRISPR-Cas9系統被開發成一種基因編輯技術。

2013 年，張鋒等設計了兩種II 型CRISPR-Cas系統，證明了Cas9核酸酶在sg RNA引導下，CRISPRCas9系統可精確編輯哺乳動物細胞基因組，并設計多個sgRNA序列應用于同時編輯基因組中的多個位點，繼而發展為CRISPR-Cas9全基因組敲除系統，該系統用于病毒篩選宿主細胞的互作基因[7]。

2 CRISPR-Cas9 全基因組敲除系統在病毒宿主作用因子鑒定中的應用

病毒通過一定的途徑入侵宿主細胞，它利用宿主細胞提供的蛋白質與核酸“原料”進行自我復制，由于病毒與宿主細胞作用因子產生相互作用，導致機體出現一系列臨床癥狀。這些“作用因子”可通過CRISPR-Cas9介導的全基因敲除系統鑒定出來。該系統是以設計不同的sgRNA作為一個包含兩萬個基因被敲除的質粒庫，以慢病毒為載體進行基因組穩轉后達到敲除效果的一個體系。在這個體系中，期望值是達到每個細胞中僅有一個基因的功能被破壞，再使用病毒侵染該體系作用下的細胞，獲得抗病毒細胞。在這整個篩選過程中必須達到以下幾個條件：必須因病毒在細胞內的擴增導致細胞死亡；由于每個過程都有可能導致sgRNA的丟失，因此要嚴格控制細胞數量以及sgRNA的使用量[8]。近幾年，CRISPR-Cas9全基因組篩選應用于以下病毒作用相關基因的篩選：2016年，Kei Haga等使用CRISPRCas9系統篩選到CD300lf 與 CD300ld，它們是感染小鼠的諾如病毒（MNV）受體[9]；2018年，Michael S.Diamond等基于CRISPR-Cas9的全基因組篩選，確定了細胞粘附分子Mxra8是部分致關節炎的甲型病毒入侵受體[10]等。這些研究成果表明CRISPR-Cas9系統在基因篩查應用中已成為一種有力工具，它的廣泛應用促進了我們對病毒致病機制的理解。

3 其他篩選技術在病毒宿主作用因子鑒定中的應用

單倍體細胞篩選是對培養的單倍體細胞系中的基因進行插入突變，使含有剪接受體位點的逆轉錄病毒基因陷阱可以整合到宿主基因組中，產生轉錄后的截短mRNA，從而破壞對應蛋白質的表達。目標蛋白表達的受阻對病毒復制產生顯著影響，以此來識別病毒感染關鍵的宿主因子。人們利用單倍體遺傳篩選已發現了埃博拉病毒和拉薩病毒是利用溶酶體蛋白作為受體[11,12]。

酵母雙雜交篩選是通過真核生物轉錄調控過程所建立的體系。真核生物中基因轉錄需要包含DNA結合結構域和DNA轉錄激活結構域在內的轉錄激活因子的參與。只有這兩個結構域在空間上充分接近時，才能發揮完整的轉錄活性，使下游基因得到轉錄。因此，酵母雙雜交篩選是基于這兩個結構域分別與待研究相互作用的兩個蛋白構建融合質粒，轉染到酵母中表達蛋白，若二者有相互作用，下游的報告基因得以轉錄，根據報告基因的表達情況，從而判斷兩個蛋白是否有相互作用[13]。研究人員利用酵母雙雜交篩選到真核翻譯起始因子（EIF4A2）與豬的胃腸炎冠狀病毒（TGEV）的復制相關[14]；確定了層粘連蛋白受體（LAMR）與草魚呼腸孤病毒（GCRV）外衣殼蛋白VP5有相互作用[13]。

RNA 干擾（RNAi）是由雙鏈RNA（DsRNA）加工成短干擾RNA（SiRNAs）SiRNAs與靶mRNAs結合后切割引起的一種基因沉默形式[15]。2015年Asiel A.Benitez等應用RNAi確定抗黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）與甲型流感病毒（IAV）入侵相關[16]；Haoyang Li等運用RNAi篩選顯示Toll4在對抗蝦白斑綜合征病毒（WSSV）感染中具有重要作用[17]。

4 CRISPR-Cas9 系統與其他篩選方法的比較

與其他篩選技術相比之下，CRISPR-Cas9全基因組篩選的優勢體現在：可鑒定促進病毒復制的宿主作用因子和抗病毒宿主作用因子。在基因功能喪失的篩查中，CRISPR-Cas9敲除細胞系中的病毒受體基因，這使細胞系對病毒感染產生抵抗力；而在基因功能增強的篩查中，病毒受體在細胞系中過表達，這使病毒增強對細胞的感染[8]。CRISPR-Cas9與單倍體細胞篩選相比，單倍體細胞篩選也可用于全基因組基因功能缺失篩選，但二者最大的區別在于單倍體細胞篩選不適于用作基因功能增強的篩查，并且單倍體細胞篩選使用的細胞類型也受限；與RNA干擾篩選相比CRISPR-Cas9篩查通常有較少的假陽性，由于短干擾RNA長度受限，較容易干擾非靶基因表達，易脫靶；與酵母雙雜交篩選相比，酵母雙雜交篩選不能用于全基因組基因功能喪失的篩查與基因功能增強的篩查，并且僅限用于真核酵母中[11,13,18]。

如上所述，CRISPR-Cas9 與其他篩選技術相比之下盡顯其優勢（表1），盡管CRISPR-Cas9脫靶效率很低，但研究人員依舊在不斷完善這個技術難題。

表1 各種篩選方案的比較

機制篩選后細胞表型基因功能影響設計脫靶效應適用的細胞類型CRISPR-Cas9敲除篩選產生出錯的NHEJ，導致移碼突變完全敲除基因，導致增強病毒感染增強每個基因設計3-6 條sgRNA SgRNA的不配對導致基因組中的脫靶切割大多數常見細胞單倍體篩選整合含有剪接受體位點基因導致截短的mRNA完全敲除基因，導致增強病毒感染增強每個基因設計525個獨立基因缺失無單倍體細胞或近單倍體細胞RNA干擾篩選短干擾RNA靶mRNAs結合，導致其切割和降解基因表達的部分下調，病毒感染增強效果不明顯每個基因4-6個短干擾RNA短干擾RNA的不配對導致脫靶mRNA大多數常見細胞酵母雙雜交篩選基因的過表達產物分析兩種蛋白質互作靶基因表達上調，導致增強病毒感染增強基因的過表達無真核酵母細胞

5 總結與展望

CRISPR-Cas9 系統作為基因工程方面的工具，開始改變生物醫學研究，包括傳染病、癌癥和基因治療。這種新的方法也被用來更好地理解病毒如何利用它們的宿主，并開發新的抗病毒方案。目前，在使用CRISPR-Cas9系統進行全基因組篩選時，還會出現以下問題：基因丟失的情況以及CRISPRCas9系統的脫靶效應，使這項技術在醫學研究領域的應用有一定的局限性。針對這些出現概率極低的問題，后續的研究者也在不斷完善，例如，在進行慢病毒的包裝時，可通過加大sgRNA質粒庫的使用濃度以及在使用慢病毒進行全基因組構建時，增加細胞數量來最大限度地防止基因丟失；而張鋒等使用Cas9核酸酶突變體和成對的引導RNA的雙重切割策略，可最大限度地減少脫靶切割，這也開始了CRISPR-Cas系統的完善[8,19]。通過對CRISPR-Cas9系統不斷完善，相信未來一定可以在醫學研究領域大放異彩。