Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)選生化湯智能提取工藝*

馬 赟，李存玉

（1.江蘇省泰州市第四人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023）

中藥處方由執(zhí)業(yè)中醫(yī)師通過對患者機(jī)體的狀況辨證開具，在調(diào)劑過程中患者根據(jù)個(gè)人需求，可委托醫(yī)院藥房代煎，或按醫(yī)囑自行煎煮。但患者常質(zhì)疑2 種煎煮方法下的成品是否存在成分差異。由于缺乏傳統(tǒng)煎煮與醫(yī)院智能提取效率的對比研究，且針對該方面的研究處于探索階段，尚不能從根本上解決患者的疑問［1-3］。中藥處方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是質(zhì)量評價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，目前多通過指標(biāo)性成分、固形物等參數(shù)進(jìn)行綜合評價(jià)［4-5］。本研究中基于醫(yī)院臨床調(diào)劑中的常用處方，結(jié)合中藥組成特點(diǎn)，選擇生化湯（組方：當(dāng)歸24 g，川芎9 g，桃仁6 g，姜炭和炙甘草各2 g）為研究對象［6］，通過陶罐直火煎煮（傳統(tǒng)方法）、智能煎藥機(jī)提取，以阿魏酸、藁本內(nèi)酯、固形物為直觀指標(biāo)，且為了保證傳統(tǒng)煎煮與智能煎煮制備生化湯中物質(zhì)基礎(chǔ)的一致性，以生化湯中藁本內(nèi)酯和阿魏酸含量比值（P1），阿魏酸、藁本內(nèi)酯總含量與生化湯煎液中固形物比值（P2）為間接指標(biāo)，優(yōu)選智能煎藥機(jī)煎煮參數(shù)，為臨床常用中藥處方的調(diào)劑、煎煮提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JY-C2 型全自動(dòng)煎藥包裝一體機(jī)（濟(jì)南玖延機(jī)械有限公司）；Agilent 1100 型高效液相色譜儀，包括VWD型檢測器（美國Agilent 公司）；AEL-40SM 型十萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；HH-S1 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州豫華儀器制造有限公司）；SK1200H 型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；101-A3型干燥箱（無錫瓊?cè)鹛乜萍加邢薰荆?/p>

1.2 試藥

阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為0773-9910，含量≥98.0%）；藁本內(nèi)酯（南京金益柏生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為JBZ-0405，含量≥98.0%）；甲醇、乙腈、三氟乙酸均為色譜純，水為超純水。當(dāng)歸、川芎、桃仁、姜炭、炙甘草飲片均來源于醫(yī)院藥劑科中藥房，經(jīng)藥劑科石梅副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿魏酸及藁本內(nèi)酯含量測定

2.1.1 色譜條件［7］

色譜柱：Agela Vensuil XBP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí)10%A →28%A，10～17 min 時(shí)28%A →65%A，17～25 min 時(shí)65%A，25～30 min 時(shí)65%A →100%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別稱取阿魏酸3.60 mg、藁本內(nèi)酯5.32 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加乙醇超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理20 min，用乙醇定容，即得阿魏酸和藁本內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為360 μg/mL 和532 μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液1：按生化湯處方工藝稱取處方飲片，按傳統(tǒng)煎煮方法加入自來水500 mL浸過藥面，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮10 min，濾過；加入自來水400 mL，采用相同方法煮沸10 min，濾過；合并2次濾液，即得。

供試品溶液2：按生化湯處方工藝稱取10倍處方量飲片，設(shè)定一體機(jī)提取參數(shù)操作，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mL，置10 mL 容量瓶中，用乙醇定容，得系列混合對照品溶液。精密量取10 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸。得回歸方程阿魏酸為Y1=492.5X1+428.3（R12=0.998 2，n=5），藁本內(nèi)酯為Y2=729.9X2-430.7（R22=0.999 6，n=5）。結(jié)果表明，阿魏酸和藁本內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別在3.60～72.00 μg/ mL 和5.32～106.40 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限與檢測限考察：精密量取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比（S/N）10∶1 和3∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度分別記作定量限和檢測限。結(jié)果阿魏酸和藁本內(nèi)酯的定量限分別為0.36，2.66 μg/ mL，檢測限分別為0.12，0.89 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下供試品溶液1 適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件，同1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果阿魏酸和藁本內(nèi)酯的日內(nèi)精密度分別為0.83%和1.15%（n=6），日間精密度分別為2.69%和4.74%（n=6），表明方法日內(nèi)、日間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下供試品溶液2 適量，分別于室溫下放置0，1，2，6，12，24 h時(shí)按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果阿魏酸、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.95%和1.31%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：按生化湯處方工藝稱取飲片適量，各6 份，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液1，再按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果阿魏酸、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為1.26%和1.75%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：按生化湯處方工藝稱取飲片適量，各6 份，加入一定量混合對照品溶液，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果阿魏酸和藁本內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為98.56%和101.32%，RSD分別為1.56%和2.04%（n=6）。

2.2 固形物含量測定

精密量取供試品50 mL，置烘干至恒重的100 mL蒸發(fā)皿中，水浴100 ℃蒸干，放至103 ℃烘箱內(nèi)烘2 h，取出，置干燥器30 min，冷卻，稱定質(zhì)量；再放至103 ℃電熱烘箱內(nèi)烘1 h，取出，置干燥器30 min，重復(fù)操作至恒重，根據(jù)公式1［G=（m-m0）/ 50］計(jì)算固形物質(zhì)量濃度。式中，G為固形物的質(zhì)量濃度（g/ mL），m為固形物和蒸發(fā)皿的質(zhì)量（g），m0為蒸發(fā)皿的質(zhì)量（g）。

2.3 間接指標(biāo)

P1和P2。計(jì)算方法見公式2（P1=m1/m2）和公式3［P2=（m1+m2）/GV］。式中，m1為生化湯中阿魏酸含量（mg），m2為生化湯中藁本內(nèi)酯含量（mg），G為固形物的質(zhì)量濃度（g/mL），V為生化湯藥液體積（mL）。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

以提取時(shí)間、加水量、提取次數(shù)3 個(gè)因素為變量，以-1，0，1 代表變量水平（見表2），進(jìn)行Box-Behnken三因素三水平試驗(yàn)［8-10］，以阿魏酸、藁本內(nèi)酯、固形物含量為指標(biāo)，優(yōu)選智能煎藥機(jī)提取工藝。方案及結(jié)果見表1及表2。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of the response surface test

2.5 回歸方程擬合與顯著性分析

阿魏酸：根據(jù)Design-Expert 8.06軟件中Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)功能，對表3 中阿魏酸含量（Y阿）結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到阿魏酸含量與考察因素變量之間的回歸方程，Y阿=120.10+38.54A+8.08B+45.01C+5.40AB+17.37AC+6.95BC-27.49A2-13.11B2-19.99C2。由表3可見，該回歸方程模型顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.129 7 ＞0.05），說明該模型用于預(yù)測、優(yōu)選阿魏酸提取參數(shù)成立。考察因素中對阿魏酸含量影響強(qiáng)度的排序?yàn)镃 ＞A ＞B，其中所考察因素間均存在顯著交互作用（P＜0.05）。

藁本內(nèi)酯：藁本內(nèi)酯含量（Y藁）與考察因素變量間的回歸方程，Y藁=170.50+127.28A+9.06B+107.09C+11.20AB+100.15AC+5.47BC+2.79A2-17.59B2-36.04C2。由見表3可見，回歸方程模型顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.091 6 ＞0.05），說明該模型用于預(yù)測、優(yōu)選藁本內(nèi)酯提取參數(shù)成立。考察因素中對藁本內(nèi)酯含量影響強(qiáng)度的排序?yàn)锳 ＞C ＞B，其中所考察因素間均存在顯著交互作用（P＜0.05）。

固形物：固形物含量（Y固）與考察因素變量間的回歸方程：Y固=118.40+47.24A+13.54B+42.90C+9.05AB+21.63AC+2.83BC-19.70A2。由表3可見，固形物回歸方程模型顯著（P ＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.5 374 ＞0.05），說明該模型用于預(yù)測、優(yōu)選生化湯中固形物提取參數(shù)成立。考察因素中對固形物含量影響強(qiáng)度的排序?yàn)锳 ＞C ＞B，其中所考察因素間AB 和AC均存在顯著交互作用（P ＜0.05）。

表3 響應(yīng)面二次回歸模型的方差分析Tab.3 ANOVA of quadratic regression model of response surface

P1：根據(jù)因素與響應(yīng)值之間的方差分析結(jié)果，調(diào)整P1與考察因素變量之間的回歸方程為P1=1.39 +0.80A-0.044B+0.53C+0.48AC+0.15A2-0.37C2。回歸方程模型顯著（P=0.000 4），相關(guān)系數(shù)R2=0.961 1，調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2=0.911 0，可用于根據(jù)P1設(shè)定值優(yōu)選因素水平。

P2：P2與考察因素變量之間的回歸方程為P2=2.47+0.61A-0.22B+0.62C-0.10AB+0.39AC-0.46C2。回歸方程模型顯著（P ＜0.000 1），相關(guān)系數(shù)R2=0.939 2，調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2=0.902 7，可用于根據(jù)P2設(shè)定值優(yōu)選相應(yīng)因素水平。

2.6 響應(yīng)面分析

阿魏酸：三因素間均存在交互作用，其中提取時(shí)間和提取次數(shù)交互作用強(qiáng)于其他二者，隨著提取時(shí)間或提取次數(shù)的增加，阿魏酸在生化湯中的含量均呈增加進(jìn)而趨于穩(wěn)定的狀態(tài)。提取次數(shù)與加水量的交互作用體現(xiàn)出，在提取次數(shù)相對固定時(shí)，6～12 倍加水量范圍內(nèi)生化湯中阿魏酸含量相對穩(wěn)定，說明6倍加水量即可滿足阿魏酸的提取。結(jié)果見圖1。

藁本內(nèi)酯：其中提取次數(shù)與提取時(shí)間交作用顯著，在提取次數(shù)為1 次時(shí)，隨著提取時(shí)間由5 min 增至20 min，生化湯中藁本內(nèi)酯含量并未出現(xiàn)明顯增加，說明在單次提取時(shí)，時(shí)間低于20 min，藁本內(nèi)酯提取效果低下。當(dāng)提取次數(shù)增加至3次時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，生化湯中藁本內(nèi)酯含量增加明顯，在提取3次、每次20 min時(shí)，藁本內(nèi)酯含量最高，說明在所考察因素水平范圍內(nèi)，藁本內(nèi)酯提取尚不完全［11-12］。而提取次數(shù)與加水量之間交互作用不顯著，呈現(xiàn)出在固定提取時(shí)間、提取次數(shù)時(shí)，增加加水量對生化湯中藁本內(nèi)酯含量影響并不明顯。結(jié)果見圖2。

固形物：其中提取次數(shù)與提取時(shí)間交作用顯著，但在固定加水量參數(shù)時(shí)，提取次數(shù)為1 次時(shí)，隨著提取時(shí)間由5 min 增加至20 min，固形物并未明顯增加。同時(shí)，固定提取時(shí)間在5 min 時(shí)，提取次數(shù)由1 次增加至3 次，生化湯煎煮液中固形物也未明顯增加，說明生化湯組方（當(dāng)歸、川芎、桃仁、姜炭、炙甘草）固形物溶出是逐漸積累的過程。結(jié)果見圖3。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

優(yōu)選出的最佳提取工藝為提取19.20 min，加6 倍量水，提取2次。按處方工藝取中藥飲片適量，采取全自動(dòng)煎藥包裝一體機(jī)煎煮。得生化湯中阿魏酸、藁本內(nèi)酯、固形物平均含量（見表4）。計(jì)算得P1為2.29，P2為3.34，均與傳統(tǒng)制備方法下的各指標(biāo)性成分比例理論值（2.32，3.38）相近，表明模擬煎藥機(jī)提取效果的模型可行，可用于生化湯的智能煎煮。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of the verification test

3 討論

2018年，國家中醫(yī)藥管理局《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》規(guī)定了經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)研究要求，強(qiáng)調(diào)復(fù)方制劑與物質(zhì)基準(zhǔn)的一致性。生化湯為婦科常用方劑，臨床使用量大，通過以傳統(tǒng)煎煮方法為基準(zhǔn)，優(yōu)選智能化煎藥機(jī)提取參數(shù)，在實(shí)現(xiàn)煎煮藥液中指標(biāo)性成分一致性的同時(shí)，也保障了臨床療效［13-14］。

響應(yīng)面分析法可通過較少的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，完成多因素、多水平考察，較正交設(shè)計(jì)法和均勻設(shè)計(jì)法更全面，可用于預(yù)測試驗(yàn)范圍內(nèi)任何試驗(yàn)點(diǎn)的理論值，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)設(shè)計(jì)的因素水平范圍要包括最優(yōu)條件［15-19］。

中藥處方的傳統(tǒng)煎煮向自動(dòng)化提取的過渡，目前多用單因素考察尋找適宜的提取參數(shù)，響應(yīng)面法可真正篩選出最優(yōu)參數(shù)，提高參數(shù)篩選效率。本研究中優(yōu)選出的最佳提取工藝為提取19.20 min，加6 倍量水，提取2 次，實(shí)際提取效果為阿魏酸含量110.30 mg，藁本內(nèi)酯含量252.73 mg，固形物含量108.45 g，與預(yù)測值相近。

采用全自動(dòng)煎藥包裝一體機(jī)制備生化湯時(shí)，采取處方量放大10倍，相較于煎藥壺中指標(biāo)性成分含量，自動(dòng)煎藥機(jī)的提取效率約為傳統(tǒng)煎煮方式的1.3倍。因處方量增加帶來的藥液體積增加，從提取開始至溶液沸騰的時(shí)間也相對延長，處方飲片的溫浸時(shí)間延長，從而引起指標(biāo)性成分含量增加［20］。臨床調(diào)劑使用時(shí)，可按一定比例稀釋，或降低藥液分裝體積，以保證服用量與煎藥機(jī)提取藥液的一致性。