雞蛋花莖皮總黃酮提取工藝優(yōu)選*

張 斌，史士強，李宗莉，周長凱，李 靜，韓志武，張 璐

（1.青島大學附屬醫(yī)院藥學部，山東 青島 266000；2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510515）

雞蛋花莖皮為夾竹桃科雞蛋花屬雞蛋花Plumeria rubraL.cv.Acutifolia 的干燥莖皮，資源豐富，藥用價值較高，其有效成分包括生物堿、黃酮、皂苷等，黃酮有抗病毒、抑菌、消炎、保肝等作用，故雞蛋花莖皮具有清熱解毒、利膽退黃、消腫止痛等功效［1］。目前對雞蛋花莖皮藥用功效的研究多只限于民間使用和記載，導致其藥用價值未能充分利用。本研究中采用正交試驗聯(lián)合星點設計-響應面法對雞蛋花莖皮總黃酮的提取方法進行了研究［2-8］，測定其總黃酮的含量，從而確定最佳提取工藝。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HH-S2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋、SHZ-D（3）型循環(huán)水式真空泵（上海申生科技有限公司）；XY-600B 型多功能粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KH-100DE 型數(shù)控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設備有限公司）；YP1002 型及JA3003N 型電子天平（德國Sartorius 公司）；UV-2401PC 型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）。

1.2 試藥

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100080-200707，含量＞98%）；無水乙醇、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純，水為蒸餾水。雞蛋花莖皮藥材，經(jīng)南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院藥用植物鑒定教研室陳興興副教授鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 溶液制備

稱取蘆丁對照品0.007 29 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加適量75%乙醇，超聲（功率100 W，頻率40 kHz，下同）使溶解，放冷至室溫，加75%乙醇定容，搖勻，即得對照品溶液（0.145 8 mg/mL）。取藥材粉末2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按各試驗設計條件進行提取、濾過，合并提取液，并以75%乙醇定容至50 mL，即得供試品溶液。

2.1.2 檢測波長選擇

取2.1.1項下對照品溶液和供試品溶液各適量，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，最后加4.0 mL 1 moL/L氫氧化鈉溶液，定容，搖勻，放置15 min，以“0”作為空白，進行全波長掃描。結果在507 nm 波長處溶液吸收較好，故以507 nm作為檢測波長。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取蘆丁對照品0，1，2，3，4，5 mL 置不同10 mL 容量瓶中，在507 nm 波長處進樣測定，以吸光度（Y）為縱坐標、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得蘆丁回歸方程Y=11.497X+0.001 6，r=1.000 0（n=5）。結果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0.014 58～0.072 90 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液3.0 mL，在507 nm波長處進樣測定，日內(nèi)平行進樣6次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定6 d，計算日間精密度。結果日內(nèi)精密度的RSD為0.19%（n=6），日間精密度的RSD為0.31%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取蘆丁對照品溶液3.0 mL、供試品溶液0.5 mL，分別置10 mL 容量瓶中，在507 nm 波長處進樣測定，室溫下分別于0，10，20，30，40，50，60 min時進樣，測定吸光度。結果的RSD為0.27%和0.68%（n=7），表明蘆丁對照品溶液及供試品溶液在室溫下放置60 min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

重復性試驗：精密吸取同一供試品溶液0.5 mL，共6 份，分別置10 mL 容量瓶中，在507 nm 波長處進樣測定，記錄吸光度。結果的RSD為0.38%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量的供試品溶液6 份，加入一定質(zhì)量濃度的蘆丁對照品溶液。在507 nm波長處進樣測定，記錄吸光度并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery tests（n=6）

2.2 單因素試驗

提取溶劑選擇：選擇不同提取溶劑，每次用量18 mL，在50 ℃下超聲60 min［9］，其他同2.1.1 項供試品溶液制備方法，精密吸取各提取液0.5 mL，在507 nm 波長處進樣測定，記錄吸光度，并計算總黃酮含量。結果水、60%乙醇、乙酸乙酯、甲醇中黃酮含量分別為2.18%，2.75%，0.16%，1.89%。可見，相同條件下，乙醇提取的黃酮含量最高，其次為水。乙醇與水相互混合比例不同能使其極性發(fā)生變化，對于提取工藝的優(yōu)化來說，具有可選擇性，故選擇乙醇作為提取溶劑。

提取方法選擇：以乙醇為提取溶劑，每次用量18 mL，分別在50 ℃下超聲、75 ℃下水浴加熱、索氏回流提取1 次，其他同2.1.1項下供試品溶液制備方法，精密吸取各提取液0.5 mL，在507 nm 波長處進樣測定，記錄吸光度，并計算總黃酮含量。結果分別為2.75%，1.84%，2.04%。可見，相同條件下，超聲提取的雞蛋花莖皮黃酮含量最高，故確定提取方法為超聲提取法。

乙醇體積分數(shù)選擇：以不同體積分數(shù)（40%，50%，60%，70%，80%，90%）的乙醇為提取溶劑，每次用量12 mL，在40 ℃下，超聲提取2次，每次60 min，放冷至室溫，稱定質(zhì)量，以相應乙醇補足減失的質(zhì)量，其他同2.1.1項下供試品溶液制備方法，精密吸取各提取液0.5 mL，在507 nm 波長處進樣測定，記錄吸光度，并計算總黃酮含量。結果分別為2.27%，2.26%，2.32%，2.28%，2.36%，2.14%。可見，提取的總黃酮含量隨乙醇體積分數(shù)的增大而增大，乙醇體積分數(shù)由40%變?yōu)?0%時含量無明顯變化，在60%～80%時含量較高，在80%時達最大值。故本研究中選用60%～80%乙醇作為提取溶劑。

2.3 正交試驗

試驗設計：在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數(shù)（因素A，%），提取時間（因素B，min），提取次數(shù)（因素C，次），提取溫度（因素D，℃）為考察因素，以黃酮含量為評價指標，溶劑用量為每次12 mL，進行L9（34）正交試驗，根據(jù)2.2 項下考察結果設計因素水平。詳見表2。

表2 正交試驗因素與水平Tab.2 Factors and levels of the orthogonal test

結果與分析：正交試驗設計與結果見表3，可見，各因素對黃酮含量的影響極差大小為A ＞C ＞B ＞D，即對總黃酮含量影響最大因素是乙醇體積分數(shù)，其次為提取次數(shù)。方差分析結果見表4，可見，乙醇體積分數(shù)對總黃酮含量有顯著影響。綜合分析，故最佳提取工藝為A2B3C3D2，即70%乙醇提取3 次，每次90 min，提取溫度為60 ℃。

表3 正交試驗設計與結果Tab.3 Design and results of the orthogonal test

表4 正交試驗方差分析結果Tab.4 Results of the ANOVA of the orthogonal test

驗證試驗：按選出的最優(yōu)工藝條件重復試驗3 次，結果總黃酮含量分別為2.39%，2.37%，2.52%（RSD=3.36%），3 次試驗結果均能達到正交試驗結果的較高值，說明最佳提取工藝條件穩(wěn)定可靠。

2.4 星點設計-響應面法優(yōu)化提取工藝

試驗設計：結合單因素試驗和正交試驗結果，以乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度為考察因素，溶劑用量為每次12 mL，提取3次。各因素的水平設計見表5、表6。

表5 星點試驗因素與水平Tab.5 Factors and levels of the central composite design experiment

表6 星點試驗設計與結果Tab.6 Design and results of the central composite design experiment

結果與分析：以總黃酮含量（Y，%）為因變量，試驗結果用Design Expert 8.0.6.1 軟件分析，進行多元二次回歸擬合，得方程Y=7.7-0.16A-0.015B-0.012C+6.38 × 10-4AB+6.94 × 10-4AC-1.69 × 10-4BC+6.74×10-4A2-1.08×10-4B2-2.19×10-4C2。方差分析結果見表7。回歸方程模型的P＜0.01，失擬性檢驗的P＜0.01，復合相關系數(shù)R2=0.848 9，表明該模型的擬合度良好，試驗誤差較小，可用于該模型預測試驗結果。模型系數(shù)顯著性結果表明，該模型的一次項A（P＜0.05）和B（P＜0.01），以及二次項AB（P＜0.05）對黃酮含量影響顯著（P＜0.05），表明乙醇體積分數(shù)和提取時間對總黃酮的含量影響顯著。綜上所述，各因素對黃酮含量的影響顯著性由大到小依次為提取時間、乙醇體積分數(shù)、提取溫度。

表7 星點試驗方差分析與結果Tab.7 Results of the ANOVA of the central composite design experiment

響應面分析：響應面優(yōu)化法在試驗條件的優(yōu)化過程中，可依次對單個試驗因素進行分析，也可連續(xù)對各個試驗因素進行分析［10-11］。用Design Expert 8.0.6.1軟件繪制不同影響因素對響應值的三維曲線圖，詳見圖2。根據(jù)模型方程和響應曲面圖確定雞蛋花莖皮總黃酮的最佳提取工藝為75.77%乙醇提取3 次，每次77.32 min，提取溫度為63.90 ℃。

驗證試驗：根據(jù)預測的雞蛋花莖皮總黃酮的最佳提取工藝條件，進行3次驗證試驗，比較預測值與真實值的差異。其中，總黃酮的預測值為1.89%，真實值分別為1.89%，1.88%，1.88%，平均1.88%（RSD=1.21%），預測值與真實值的偏差約為0.01%。說明建立的模型預測性較好，可用于雞蛋花莖皮總黃酮的提取工藝優(yōu)化。

3 討論

超聲提取是利用超聲波具有的機械、空化和熱效應，通過增大介質(zhì)分子的運動速度、穿透力以提取生物的有效成分［12］。而水浴加熱提取和索氏回流提取是利用熱效應來加快介質(zhì)分子的運動以提取生物的有效成分。因此，本研究中選擇的超聲提取更加充分和全面，這也為中藥提取方法的研究提供了依據(jù)。

考察提取溶劑、乙醇體積分數(shù)在單因素試驗中，選取了60%～80%乙醇為提取溶劑［13］。黃酮成分的存在形式包括苷和苷元，苷元極性小，而苷極性較大，前者難溶于水，但易溶于乙醇等有機溶劑，后者易溶于水、乙醇、甲醇等極性較強的溶劑。因此，乙醇對黃酮的溶解性較大，其與水的不同濃度梯度也為黃酮的提取提供了更多選擇，且以水與乙醇為溶劑提取時操作簡單，成本較低。

本研究中2 種試驗方法所優(yōu)化的最佳工藝結果相近，星點設計的試驗次數(shù)比正交試驗多，但優(yōu)化工藝更準確直觀，且因素水平范圍設計更加合理、準確。響應值多在最佳工藝條件附近變化靈敏，試驗條件的微小變化都會產(chǎn)生較大變化，而試驗條件遠離優(yōu)化區(qū)域，其變化趨勢逐漸減小，線性越好，故所選星點設計適用于非線性模型擬合，而本研究中也通過模型擬合進行了二次項擬合，該模型也具有顯著性。

本研究中由于試驗期間方案設計不合理，重復某一環(huán)節(jié)多次，以致原藥材不足，星點設計-響應面法試驗中所用藥材為第2次采割，但由于雞蛋花莖皮為不同季節(jié)（2015年7 月、2016年3 月）采割，黃酮含量差異較大［14-15］，可能是黃酮成分受溫度影響較大，部分已轉化為異構體或其他成分，但并不影響本研究中雞蛋花莖皮黃酮提取工藝的優(yōu)化。