內質網應激在年齡相關性黃斑變性中的研究進展

劉 霞，王 艷，江華維，任玉玲，陳 晨

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是一種影響視網膜黃斑區域，導致中心視力進行性喪失的疾病，也是50歲以上老年人視力下降甚至失明的主要原因之一[1]。2015年全球失明人口所有年齡段失明原因中ARMD排第四位，在導致中重度視力障礙原因中排第三位(僅次于屈光不正和白內障)，在人口老齡化地區ARMD的致盲比例更高[2]。ARMD分為干性ARMD和濕性ARMD，前者的主要表現是黃斑區玻璃膜疣形成和地圖樣萎縮，后者的主要表現是脈絡膜新生血管形成[3]。視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞是位于視網膜最外層的單層六角形細胞，富含色素顆粒，且具有極性。RPE功能失調與ARMD關系密切[4]。目前ARMD的發病機制尚未完全闡明，但大量研究發現多種危險因素介導的內質網應激在該病的發生發展中起著重要作用。本文就內質網應激的信號轉導通路、內質網應激在視網膜色素上皮細胞中的生理作用及其在ARMD發病機制中的研究進展作一綜述。

1內質網與內質網應激

內質網是真核細胞內一種特殊的膜性細胞器，承擔著跨膜蛋白和分泌蛋白的合成、折疊、組裝、修飾的任務，同時也是脂肪、甾體合成以及Ca2+儲存的主要場所[5]。蛋白折疊是一個非常容易出錯的過程，Ca2+水平失調、蛋白合成水平提高、持續的氧化應激、營養物質過多或限制、毒素刺激、缺氧、基因突變等因素均可影響蛋白的正常折疊或運輸，導致大量未折疊蛋白和/或錯誤折疊蛋白積聚在內質網腔，此種狀態即稱為內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)[6]。此時，細胞內會產生適應性的信號轉導級聯反應——未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)來緩解內質網應激。如果強烈的內質網應激持續存在，動態平衡難以恢復，將啟動細胞凋亡程序清除受損細胞來保護機體[7]。

2內質網應激中的UPR

UPR主要通過三種跨膜蛋白激活信號級聯反應：活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)，蛋白激酶樣內質網激酶(protein kinase-1ike ER kinase，PERK)以及肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)。生理條件下，這三種跨膜蛋白的內質網腔內部分均與葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)結合，處于非活化狀態。內質網應激時，GRP78解離引起跨膜蛋白的活化，啟動UPR[8-9](圖1)。

圖1 UPR的信號轉導機制示意圖。

2.1IRE1介導的UPR IRE1是位于內質網的一種跨膜激酶，存在于所有真核生物中，結構非常保守[10]。內質網應激時，IRE1與GRP78解離，通過自身磷酸化而激活其核酸內切酶功能[11]。轉錄因子X盒結合蛋白1(X box-binding protein 1, XBP1)的mRNA是其底物。IRE1從XBP1的mRNA上剪掉一個26堿基對的片段，該mRNA兩個斷端重新連接后，其編碼蛋白發生改變，表達剪切型XBP1(XBP1s，XBP1的活性形式)。XBP1s進入細胞核，增強其下游基因表達，調節內質網蛋白的折疊和運輸、磷脂生物合成以及內質網相關的蛋白降解，從而增強細胞對環境變化的適應性[12]。另一方面，IRE1的核酸酶活性能裂解多種RNA，從而降低內質網mRNA豐度和蛋白折疊負荷，這一過程稱為受調節的IRE1依賴的裂解(regulated IRE1-dependent decay，RIDD)。RIDD可以裂解大量位于內質網和細胞漿的mRNA、核糖體RNA和小RNA，在調控葡萄糖代謝、炎癥、凋亡等過程中起著重要的生物學作用[13]。如果內質網應激無法緩解，IRE1將激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，介導細胞凋亡[7]。

2.2PERK介導的UPR 同IRE1一樣，PERK也是內質網定位的跨膜蛋白，與GRP78解離后，通過自身磷酸化而激活。內質網應激時，激活的PERK在Ser51處磷酸化真核翻譯起始因子2(eukaryotic translation initiation factor 2, eIF2)的α亞基。磷酸化的eIF2α抑制總體蛋白翻譯，從而降低內質網蛋白負荷，緩解內質網應激。另一方面，磷酸化的eIF2α可特異性增加轉錄激活因子4(activating transcription factor 4, ATF4)的翻譯。ATF4進入細胞核，促進細胞存活相關基因的表達，激活自噬、抗氧化反應，維持蛋白的合成和運輸。C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)是一個前凋亡因子，內質網應激時被ATF4激活，通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的轉錄并增加死亡受體5(death receptor 5,DR5)的基因表達，介導細胞凋亡[14-15]。

2.3ATF6介導的UPR ATF6是一種Ⅱ型跨膜蛋白，包含亮氨酸拉鏈結構域。內質網應激時，ATF6與GRP78解離，再與外殼蛋白Ⅱ(COPⅡ)復合物相互作用被轉運到高爾基體，然后被S1P和S2P兩種蛋白酶切割為兩部分，釋放出穩定的bZIP轉錄因子ATF6-N。ATF6-N進入細胞核，參與轉錄因子CHOP、XBP1表達的調控，激活與蛋白折疊相關的基因表達，幫助恢復內質網蛋白折疊的動態平衡[16-17]。ATF6的轉運與激活是受到高度調控的過程，該過程與內質網駐留蛋白18(ERp18)相關。ERp18是一種氧化還原酶，它介導ATF6與GRP78的離解，并調節ATF6轉出內質網的過程。ERp18缺失時，ATF6無法被S1P或S2P蛋白酶正確切割，因而不能產生其活性形式ATF6-N[18]。

3內質網應激與ARMD

Lenox等[19]研究發現，正常老化視網膜中，內質網穩態破壞導致UPR激活，氧化應激和炎癥信號增加。各種危險因素(如年齡、吸煙、光損傷等)都可以在視網膜中引起內質網應激，導致ARMD的發生發展[20-21]。接下來將從內質網應激與氧化應激、炎癥、自噬、細胞凋亡、血管生成和RPE分泌蛋白失衡的相互作用來介紹內質網應激與ARMD發病機制的關系。

3.1內質網應激與氧化應激氧化應激是ARMD發生發展中最重要的機制。生理情況下，活性氧(reactive oxygen species，ROS)對于正常細胞功能維持是必要的，而吸煙、高脂飲食等危險因素將刺激細胞產生過多ROS，損傷細胞蛋白和DNA，損害細胞生理功能[22]。RPE細胞具有強大的抗氧化能力，其中NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是對抗氧化應激最重要的調節分子。Nrf2是一種bZIP轉錄因子，它能與抗氧化反應元件(antioxidant response elements, ARE)結合，激活一系列含有ARE的抗氧化基因，對ROS誘導的視網膜細胞凋亡有保護作用[23-24]。Nrf2基因敲除的小鼠表現出玻璃膜疣樣沉積、脂褐質堆積、自發性脈絡膜新生血管等與人類ARMD相似的表型[25]。在ARMD中，內質網應激與氧化應激有較多的交互作用。Cullinan等[26]研究發現，Nrf2是PERK的直接底物，PERK可以磷酸化Nrf2，使其與抑制蛋白Keap1離解，進入細胞核。由此可見，PERK通路雖然通過eIF2α/ATF4/CHOP信號誘導細胞凋亡，卻通過Nrf2信號保護細胞生存。He等[27]發現，ATF4可以與Nrf2形成二聚體，共同調節抗氧化酶血紅素加氧酶1(Heme oxygenase-1, HO-1)的表達。而我們之前的研究[28]發現XBP1對Nrf2有調節作用，在ARPE-19細胞中過表達剪切型XBP1后，Nrf2的水平也增加；在RPE特異性XBP1基因敲除的小鼠，Nrf2的表達也顯著降低。這些研究證明，調控內質網應激可以影響氧化應激的關鍵分子Nrf2，進而影響細胞的抗氧化反應。

3.2內質網應激與炎癥玻璃膜疣位于RPE與Bruch膜之間，是ARMD的典型體征。玻璃膜疣的成分包含很多炎癥相關物質，包括補體成分、免疫球蛋白、人類白細胞抗原和急性時相蛋白等，這證明炎癥與ARMD密切相關[29]。有學者[30]提出ARMD發生的兩級模型假設：第一級是人眼在光、吸煙、衰老等危險因素作用下，各種損傷分子如補體因子、白細胞介素等不斷積累。第二級是這些損傷分子誘發的炎癥宿主反應。這種(無菌性)炎癥反應造成細胞和組織的額外損傷，最終發展為ARMD。

內質網應激時，IRE1信號通路可以使核因子κB抑制蛋白IκB(I kappa B Proteins)降解，從而激活核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)。PERK-eIF2α通路則減少IκB的蛋白翻譯，使得NF-κB得以入核。NF-κB通過調節細胞因子、趨化因子、生長因子和血管生成因子的轉錄在炎癥反應中起關鍵作用。UPR的另一條通路，ATF6，可以激活急性時相反應[31-32]，活化的ATF6在細胞核內調節急性時相蛋白的基因轉錄。Kheitan等[33]通過構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡對ARMD中內質網應激和炎癥的相互關系進行研究，發現MAPK信號通路是與內質網應激和炎癥交叉作用相關度最高的通路。MAPK信號通路通過對不同刺激的磷酸化反應來調節轉錄因子的活性，如通過JNK和p38/MAPK的活化來調節RPE細胞的凋亡。由此可見，ARMD中內質網應激和炎癥常常同時存在而相互影響。

3.3內質網應激與自噬功能障礙自噬是一種溶酶體介導的降解過程，將非必須或已損害的細胞成分降解來為細胞供能，維持細胞內環境平衡[34]。研究發現，隨年齡增加，RPE自噬能力逐漸下降，光感受器外節以及脂褐質在RPE和Bruch膜之間積累[35]。RPE自噬功能障礙與ARMD的發生發展密切相關[36]。Golestaneh等[37]報道，ARMD患者的RPE細胞中，自噬體變大，脂滴變多，且自噬體和受損線粒體的數量顯著多于正常RPE。自噬功能障礙會導致異常蛋白和ROS在內質網積聚，從而導致內質網應激。Feng等[38]研究發現，內質網分子伴侶GRP78能誘導RPE自噬增加，用siRNA抑制GRP78表達后，RPE自噬功能降低。自噬誘導劑雷帕霉素可以減少內質網應激，從而保護RPE細胞免受藍光誘導的凋亡。Song等[39]報道，可見光在體外培養的RPE細胞中誘導自噬增加，持久過強的自噬引起RPE細胞凋亡。小鼠腹腔注射內質網應激抑制劑Salubrinal后再暴露于強光，此時強光誘導的自噬較對照組少，強光導致的視網膜結構異常顯著輕于對照組，可見抑制內質網應激能減少過多的自噬而保護RPE細胞。

3.4內質網應激與細胞凋亡RPE細胞密度隨年齡增加而下降，其凋亡率隨年齡增加而增加[40]。RPE細胞凋亡是干性ARMD的重要標志[41]。UPR的PERK通路和IRE1通路可通過不同的機制導致細胞凋亡。PERK激活eIF2α，后者抑制總體蛋白合成來減輕內質網應激，但持久過強的抑制蛋白合成不利于細胞存活；PERK通路還激活前凋亡蛋白CHOP，抑制Bcl-2的轉錄而誘導細胞凋亡。同時，IRE1磷酸化可活化RIDD，過強的RIDD可降解位于內質網的幾百種mRNA，剝奪了內質網的蛋白組分，反而加重內質網應激，引起細胞凋亡[7,13,42]。

吸煙是ARMD的獨立危險因素，煙霧中有多種成分可損傷視網膜[43]。我們前期的研究發現，在吸煙小鼠模型中，RPE中的XBP1s和CHOP的mRNA水平顯著升高，而神經視網膜中XBP1s的mRNA水平亦顯著上升，這說明內質網應激參與了吸煙導致ARMD的過程。我們進一步研究發現，香煙煙霧的主要成分氫醌在RPE細胞中誘導GRP78、PERK、eIF2-α、ATF4、CHOP的表達，最后激活caspase3，導致細胞凋亡。同時，內質網應激抑制劑4-苯基丁酸能抑制前凋亡蛋白CHOP的水平，從而抑制氫醌誘導的RPE凋亡。更深入的機制研究發現,用過表達顯性負性突變PERK的腺病毒感染細胞，使正常PERK被抑制后，氫醌誘導的RPE凋亡顯著減少，說明氫醌誘導RPE凋亡主要是通過PERK通路。另一方面，剪切型XBP1則對RPE凋亡有保護作用。利用腺病毒在RPE細胞中過表達剪切型XBP1后，氫醌誘導的細胞凋亡顯著下降[44]。由此可見，調控內質網應激可以影響RPE細胞凋亡。

3.5內質網應激與血管生成RPE細胞過量表達血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)導致脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成是濕性ARMD發生的關鍵環節。內質網應激時，UPR的PERK通路可以激活ATF4，IRE1通路可以激活JNK，ATF4和JNK可以直接調節VEGF的轉錄，使其水平升高[45-46]。Pollreisz等[47]研究發現，氧化磷脂(一類脂質氧化產物)在人胚胎RPE細胞和原代RPE細胞中增加VEGF的mRNA水平，并使細胞分泌的VEGF增加。siRNA阻斷細胞內ATF4信號后，氧化磷脂誘導的VEGF表達顯著下降，說明ATF4在氧化磷脂誘導的VEGF表達中是必需的。這證實了內質網應激在RPE分泌VEGF過程中的作用。

目前，抗VEGF注射在濕性ARMD的治療中取得了確切療效。然而，ANCHOR、MARINA等臨床試驗表明，抗VEGF治療后新生血管的消退經常并不完全，也不持久[48],我們仍然需要新的ARMD治療靶點。Liu等[49]研究發現，在視網膜血管內皮細胞中，外源性VEGF、高糖、過氧化氫均能誘導UPR，激活IRE1和ATF6，抑制細胞內VEGF裂解，使VEGF聚集。siRNA抑制IRE1和ATF6表達后，細胞內VEGF裂解顯著增加，內皮細胞成管顯著減少。在激光誘導的CNV小鼠模型中，玻璃體腔注射IRE1或ATF6的siRNA后，CNV形成減少35%以上。當siRNA處理聯合抗VEGF治療時，CNV形成減少60%以上。這一研究證實了內質網應激在CNV形成中的作用，并為濕性ARMD治療提供了新的靶點。

3.6內質網應激與RPE分泌蛋白失衡RPE分泌蛋白的平衡對維持光感受器細胞和Bruch膜/脈絡膜的結構和功能至關重要[50]。RPE頂部分泌的蛋白主要有透明質酸，αB晶體蛋白，色素上皮衍生因子等；其基底部分泌的蛋白主要有血管內皮生長因子，成纖維細胞生長因子5，內皮素Ⅰ等[51]。內質網在RPE分泌蛋白平衡中起著質控作用。內質網應激時，蛋白折疊和運輸功能受損，可能有錯誤折疊的蛋白被分泌到細胞外，影響組織的正常生理功能[50-52]。

Luibl等[53]在人類玻璃膜疣標本中發現了淀粉樣蛋白的存在。Wang等[54]研究發現，24月齡的小鼠RPE分泌的淀粉樣蛋白明顯比2月齡小鼠RPE分泌的淀粉樣蛋白多。β淀粉樣蛋白具有毒性作用，可以導致RPE空泡產生和視網膜細胞老化,還可激活補體級聯反應，誘導RPE分泌VEGF，促進ARMD發生[55-56]。Plate等[57]和Wang等[58]研究發現，UPR的ATF6通路能減少淀粉樣免疫球蛋白輕鏈的分泌，而XBP1通路能增加內質網對淀粉樣免疫球蛋白輕鏈的降解，證明UPR在淀粉樣蛋白的分泌中有調控作用。Matsui等[59]研究發現，β淀粉樣蛋白在RPE細胞中誘導VEGF的分泌，而用內質網應激抑制劑4-苯基丁酸同時處理細胞后，受刺激分泌的VEGF水平顯著降低。因此Matsui等[59]指出內質網應激抑制劑可能在伴有玻璃膜疣的ARMD患者中有預防新生血管生成作用。

4小結與展望

綜上所述，大量研究證實ARMD與內質網應激密切相關。目前針對ARMD的治療手段比較有限，抗VEGF療法治療濕性ARMD也具有一定的療效差異性和遠期局限性。對于干性ARMD的治療，除了干細胞治療已經進入臨床研究階段，尚無有效藥物可以挽救RPE細胞的凋亡和感光細胞的損傷。未折疊蛋白反應作為內質網應激主要的信號通路，與炎癥、氧化應激、自噬等機制相互作用，形成一個復雜的調控網絡。UPR的三條信號通路早期可以通過誘導自噬和抗氧化反應、調控炎癥信號來恢復內質網穩態，但長期過度的UPR激活可能導致自噬功能障礙、炎癥信號增加、ROS聚集而誘導細胞凋亡。了解以持續UPR為特征的年齡相關性視網膜疾病的分子機制，從UPR的上下游研究如何調控相關基因表達以維持細胞或組織正常生理代謝，進一步探討內質網應激在ARMD發生發展中的作用，有助于為ARMD治療提供新的思路和可能的分子靶點。