海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變關(guān)系

吳清靜 ，吳佩佩，魯 曉，彭 立,2 ，邢 球， 謝 青

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是一種常見的致盲眼病，是最嚴(yán)重和最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，已在中老年人群中成為最常見的導(dǎo)致視力損害和不可逆性失明的原因之一[1-2]，DR在糖尿病人群中的患病率大約為三分之一，其中十分之一的人有視力下降，如糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema, DME)或增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy, PDR)。DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無明確一致的發(fā)病機(jī)制可以解釋該疾病的發(fā)生發(fā)展。DR 的發(fā)生發(fā)展與糖尿病本身以及患者的血糖控制情況密切相關(guān)，此外DR的發(fā)生亦具有顯著的個(gè)體差異和家庭聚集性。有文獻(xiàn)報(bào)道DR的發(fā)生有27%的遺傳可能性，PDR患者的遺傳性更高，可達(dá)52%[3]，DR的發(fā)生、發(fā)展與遺傳因素有著密切的關(guān)系。

DR患者的視功能和生存質(zhì)量隨著DR的發(fā)展受到嚴(yán)重的影響[4-5]，早期發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)的DR患者，早期提供最佳的預(yù)防和治療措施，將極大地改善DR患者的視功能預(yù)后與生活質(zhì)量。臨床上DR損害患者視功能的主要原因?yàn)橐暰W(wǎng)膜新生血管的生成和黃斑水腫的發(fā)生，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在DR新生血管的生成中扮演者重要角色，有著密切的關(guān)系[6]。

近幾年分子生物學(xué)研究得到快速發(fā)展，識(shí)別早期診斷的生物標(biāo)志物、預(yù)后預(yù)測和DR的靶向治療是非常重要的[7]，關(guān)于DR在基因?qū)用娴目茖W(xué)研究逐漸增多，不斷引起學(xué)者的重視，生長因子基因多態(tài)性與DR 發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究是當(dāng)前國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，對(duì)評(píng)價(jià)DR的嚴(yán)重程度以及探索新療法的研究中起著重要的作用，為研究DR新的治療靶點(diǎn)提供重要的依據(jù)和支持。黎族屬于少數(shù)民族，中國有125萬黎族人口，其中111萬來自海南[8]，而海南作為中國唯一的熱帶地區(qū)，本地區(qū)的人群的基因多態(tài)性與DR 相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道，我們旨在探索海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因多態(tài)性與DR的關(guān)系，為早期糖尿病患者的預(yù)防、診斷提供有力的依據(jù)。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象前瞻性研究。隨機(jī)收集2016-09/2019-10海口市人民醫(yī)院眼科和內(nèi)分泌科住院的海南黎族2型糖尿病患者89例，其中男49例，女40例。依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的糖尿病診斷和糖代謝狀態(tài)分類標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施。納入標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)滿足以下要求：(1)2型糖尿病；(2)祖籍為海南黎族，3代以上父母雙方均為海南黎族人；(3)糖尿病病程≥8a；(4)所有患者均接受眼科檢查(最佳矯正視力、裂隙燈顯微鏡+90D非接觸鏡、眼底照相、OCT、FFA)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有酮癥酸中毒、心力衰竭、高血糖高滲性昏迷、腦梗塞急性期、尿毒癥(肌酐≥707μmol/L)、妊娠期糖尿病、1型糖尿病者；(2)既往有高血壓性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、眼底血管樣條紋、中心性漿液性視網(wǎng)膜病變、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、息肉狀脈絡(luò)膜血管病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜靜脈周圍炎、脈絡(luò)膜新生血管病史者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，通過海口市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1一般資料收集通過問卷咨詢調(diào)查、查閱相關(guān)病例、進(jìn)行相關(guān)體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行臨床各項(xiàng)指標(biāo)的收集。所有患者禁食12～14h，晨起空腹抽取肘靜脈血，應(yīng)用全自動(dòng)生化儀測肌酐、尿素、總膽固醇、甘油三酯；低壓液相層析柱法(EDTA抗凝全血，EDTA:血量=1.5mg/mL)測糖化血紅蛋白(HbA1c)。

1.2.2提取基因組DNA 采集納入研究對(duì)象的EDTA抗凝血3mL，按照實(shí)驗(yàn)步驟提取研究對(duì)象的基因組DNA。

1.2.3檢測基因多態(tài)性應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性檢測分析法對(duì)研究對(duì)象提取的樣本進(jìn)行基因多態(tài)性檢測。引物的設(shè)計(jì)根據(jù)基因序列和相關(guān)文獻(xiàn)。VEGF基因rs2010963位點(diǎn)PCR擴(kuò)增全長度為224bp，上游引物為5’-GGATTTTGGAAACCAGCAGA-3’，下游引物為5’-CTGTCTGTCTGTCCGTCAGC-3’。VEGF基因rs3025039位點(diǎn)PCR擴(kuò)增全長度為317bp，上游引物為5’-GGGAACCAGATCTCTCACCA-3’，下游引物為5’-TGTATGTGGGTGGGTGTGTC-3’。PCR反應(yīng)體系中含2X Goldstar Buffer Mix 10μL，H2O 6μL，DNA 100ng(≈1μL)，Primer Mix 3μL。將配置好的PCR反應(yīng)體系液置入PCR檢測儀里，按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行下一步的PCR檢測。按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行樣品的基因測序，隨后進(jìn)行上機(jī)電泳，應(yīng)用ABI 3130/ABI 3130XL測序儀實(shí)施樣品的測序，對(duì)樣品的rs2010963、rs3025039位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)檢測。

2結(jié)果

2.1三組患者臨床資料比較參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼底病學(xué)組的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)DR進(jìn)行分組：非增殖期DR(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)患者30例和增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者33例。將2型糖尿病無視網(wǎng)膜病變(diabetic without retinopathy,DWR)患者26例作為對(duì)照。三組患者平均年齡、糖尿病病程、收縮壓、舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、糖化血紅蛋白比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PDR患者尿素、肌酐水平較DWR和NPDR組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.016667)，見表1。

表1 三組患者臨床資料比較

2.2三組患者VEGF基因rs2010963檢測結(jié)果三組患者均存在CC、CG及GG三種基因型和C、G兩種等位基因，見圖1。該位點(diǎn)的基因型分布頻率與Hardy-Weinberg平衡定律一致。三組患者各基因分布情況見表2。Fisher精確檢驗(yàn)結(jié)果顯示三組患者CC基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，進(jìn)一步兩兩比較顯示：DWR和NPDR組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)，NPDR組和PDR組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.435)，DWR和PDR組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。三組患者CG基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(χ2=10.046，P=0.006)，進(jìn)一步兩兩比較顯示：DWR和NPDR組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.067)，NPDR組和PDR組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.168)，DWR和PDR組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。三組患者GG基因型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.230，P=0.893)。三組患者C和G等位基因分布比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.384，P=0.184;χ2=3.384，P=0.184)，見表2。結(jié)果提示CC基因型增加PDR的易感性。

圖1 海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs2010963位點(diǎn)各基因型測序圖 A：CC基因型；B：CG基因型；C:GG基因型。

表2 三組患者VEGF基因rs2010963基因型及等位基因分布比較n(%)

2.3三組患者VEGF基因rs3025039位點(diǎn)檢測結(jié)果三組患者均存在C、T兩種等位基因和CC、CT兩種基因型，NPDR和PDR組還存在TT基因型，見圖2。三組患者VEGF基因rs3025039基因型及等位基因分布比較見表3。

圖2 海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs3025039位點(diǎn)各基因型測序圖 A：CC基因型；B：CT基因型；C:TT基因型。

表3 三組患者VEGF基因rs3025039基因型及等位基因分布比較n(%)

Fisher精確檢驗(yàn)結(jié)果顯示，三組患者CC、CT、TT基因型比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.835、0.950、0.773)。三組患者C和T等位基因分布比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.028，P=0.598；χ2=1.028，P=0.598)。

2.4三組患者不同基因型與PDR發(fā)生率的比較與基因型為TT的研究對(duì)象相比，等位基因C攜帶者患PDR的危險(xiǎn)性較高[82%(54/66)vs6%(2/33)]。

3討論

本研究采用PCR結(jié)合DNA測序法方法首次對(duì)中國海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs2010963和rs3025039的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行研究。以上兩個(gè)單核苷酸位點(diǎn)在VEGF的轉(zhuǎn)錄及翻譯過程中起著不容忽視的重要作用，但因種族、地區(qū)及生活方式的不同，它們與DR的相關(guān)性存在較大差異。海南島地理位置特殊，有獨(dú)特的海洋氣候，黎族是海南的土著居民，歷代多居住于山地及丘陵地帶，缺乏與外界交流，再加上相對(duì)封閉保守的婚戀原則，與外族人通婚較少，導(dǎo)致黎族基因具有其保守性和獨(dú)特性，目前鮮有黎族人群的相關(guān)報(bào)道。單核苷酸多態(tài)性的研究較多[9]，是人類最常見的遺傳變異形式，估計(jì)占人類遺傳變異的90%以上，是當(dāng)基因組序列中的單個(gè)核苷酸發(fā)生改變時(shí)所發(fā)生的DNA序列變異，在多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[10]。VEGF是一種有效的血管生成和血管通透性因子，其多態(tài)性與DR的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[11]。

Watson等[12]對(duì)英國健康人群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)VEGF基因單核苷酸多態(tài)性與VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)，其中rs2010963位點(diǎn)攜帶G等位基因可使VEGF基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，從而使VEGF蛋白濃度增加。且攜帶GG基因型的個(gè)體血漿VEGF含量最高，CG基因型次之，CC基因型的含量最低。rs2010963中的CC基因與VEGFA分泌減少有關(guān)[13]。我們的研究結(jié)果顯示，DWR組、NPDR組與PDR組中均存在CC、CG及GG三種基因型和C、G兩種等位基因。三組中CC基因型分布頻率分別約為4%、30%和39%，CG基因型頻率分別為58%、33%、和18%，GG基因型分布頻率依次是38%、37%和42%。與DWR相比，PDR組CC基因型頻率顯著增高，CG基因型明顯降低，NPDR組CG基因型略降低。在海南黎族2型糖尿病患者中，rs2010963位點(diǎn)的CC基因型增加PDR的易感性。我國學(xué)者Yuan等[10]對(duì)河北石家莊地區(qū)的漢族2型糖尿病患者進(jìn)行基因位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)NPDR組、PDR組與無DR組在rs2010963位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率上無顯著差異。文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)中國臺(tái)灣地區(qū)糖尿病患者進(jìn)行基因檢測發(fā)現(xiàn)攜帶CC或CG基因型的患者的DR患病率明顯高于攜帶GG基因型患者，且C等位基因患者中VEGF的表達(dá)水平增高[14]。伊朗學(xué)者Fegghi等[15]研究發(fā)現(xiàn)在rs2010963位點(diǎn)GG基因型是PDR患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，攜帶GG基因型患PDR的概率為攜帶CC基因型的1.87倍。韓國的一項(xiàng)研究顯示，韓國2型糖尿病人群中PDR、NPDR、DWR在rs2010963位點(diǎn)上各基因型及等位基因上無明顯差異[16]。文獻(xiàn)報(bào)道CC基因型在DWR組中比例最高，而GG基因型則在PDR組中比例最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[17]。rs2010963在其他疾病中也被報(bào)道過，如冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[18]，與先兆子癇發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有顯著的相關(guān)性[19]。rs2010963位點(diǎn)與VEGF基因的激活蛋白-1緊密連接，參與VEGF蛋白產(chǎn)物的表達(dá)[20]，且還有研究發(fā)現(xiàn)它可以改變VEGF基因啟動(dòng)子的反應(yīng)活性[21-22]。不同地區(qū)的人群，不同的民族群體間在rs2010963存在多態(tài)性。VEGF的增加導(dǎo)致PDR的發(fā)生，視網(wǎng)膜缺血是VEGF分泌的主要刺激因子，導(dǎo)致PDR[23]。

rs3025039位點(diǎn)可通過激活蛋白-4發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)血漿VEGF水平[24-25]。這些位點(diǎn)的多態(tài)性都可能影響VEGF的轉(zhuǎn)錄水平或表達(dá)水平，與DR的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。一項(xiàng)Meta分析顯示在等位基因模型中發(fā)現(xiàn)rs3025039(C>T)多態(tài)性與DR風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)[26]。我們的研究顯示三組之間rs3025039在等位基因分布方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是NPDR和PDR組還存在TT基因型，黎族2型糖尿病患者患者在rs3025039位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與DR的發(fā)生相關(guān)性不顯著，可能與我們的人群特性有關(guān)。此外，不同的DME患者個(gè)體對(duì)抗VEGF治療的反應(yīng)并不相同，DME抗VEGF治療反應(yīng)的個(gè)體間差異可能部分是由于VEGF基因的多態(tài)性和/或VEGF基因表達(dá)的差異所致[27]。因此，VEGF的單核苷酸多態(tài)性可能在DR的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用，VEGF基因的多態(tài)性可能在抗VEGF的治療反應(yīng)中起到?jīng)Q定性作用。

在國內(nèi)海南黎族的人群中，rs2010963和rs3025039尚未被報(bào)道過。本研究也存在局限性，首先我們的研究樣本量有限，可能不能完全評(píng)估基因的多態(tài)性情況，其次雖然我們首次對(duì)海南黎族人群進(jìn)行了研究，但是缺少大樣本的和漢族人群的對(duì)比研究。

綜上所述，海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs2010963位點(diǎn)的CC基因型較CG基因型增加糖尿病患者DR的易感性，海南黎族DR患者主要為CC基因型。而在rs3025039位點(diǎn)上，黎族NPDR和PDR組還存在TT基因型，在rs3025039位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與DR的發(fā)展相關(guān)不顯著。本研究運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)測定VEGF基因型，探索海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因多態(tài)性與DR的相關(guān)性，探尋DR發(fā)生的遺傳學(xué)證據(jù)，為早期預(yù)防、診斷提供有力的依據(jù)，期望能為DR提供更有效的治療手段。