利用分子量印跡快速篩選活心丸中蟾蜍二烯酸內酯和二萜生物堿類化合物△

李菡，張珂，廖弈秋，莫尊匯，劉菊妍，宋月林，趙云芳*，宋青青*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100029；

2.廣州白云山醫藥集團股份有限公司 白云山制藥總廠，廣東 廣州 510515；

3.廣東省化學藥原料與制劑關鍵技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510515；

4.廣州醫藥集團有限公司，廣東 廣州 510103

活心丸由人參、附子、蟾酥、紅花、熊膽、牛黃等10 味中藥組成，具有益氣活血、溫經通脈的功效，臨床上廣泛地應用于冠心病、心絞痛的治療[1]。其中，附子和蟾酥為方中兼具藥效和毒性的“毒效雙性”中藥，但相對安全劑量范圍比較狹窄。中藥的毒性源于所含的毒性成分，現代研究表明附子和蟾酥的毒性成分亦是藥效成分[2-3]。附子中的烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型二萜生物堿具有較強毒性，炮制后水解生成的苯甲酰烏頭原堿、新烏頭原堿等單酯型和醇胺型二萜生物堿毒性減弱，且具有強心、抗炎等藥理作用[4-5]。蟾酥中蟾蜍二烯酸內酯類化合物如蟾毒靈、脂蟾毒精等，具有抗腫瘤、抗炎、強心等藥理作用[6-7]，長期或過量服用蟾酥可出現循環系統、神經系統等中毒癥狀。目前，活心丸的質量標準仍執行中華人民共和國衛生部藥品標準中藥成方制劑第十八冊[8]（標準文號：WS3-B-3452-98），僅有少數幾味藥的薄層鑒別，未能對附子中二萜生物堿及蟾酥中蟾蜍二烯酸內酯類成分嚴格控制，無法全面保證活心丸的質量。因此，闡明活心丸中附子和蟾酥來源的化學成分，既能保證活心丸藥效，又能控制其潛在的毒性，是建立活心丸質量控制標準的重要環節。

然而，活心丸中藥味多，化學成分復雜，極大地增加了成分分析的難度。近年來，由于超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜法（UPLC-Q-TOFMS）具備靈敏度高、分析速度快、分辨率高等優勢，已被廣泛地用于中藥等復雜基質中化學成分的快速定性表征研究。然而，采集到的質譜圖譜中通常會存在基質中干擾離子、同位素離子、加合離子、多電荷離子等冗余質譜信息，對目標化合物尤其是痕量化合物的圖譜解析產生嚴重干擾。因此，從復雜數據集中有效地挖掘目標化合物的質譜信息已成為快速鑒定的關鍵。目前，已有較多質譜數據的后處理技術[9]，如分子量印跡（molecular weight imprinting，MWⅠ）[10]、診斷離子過濾（diagnostic fragment ion filtering，DFⅠF）[11]、中性丟失過濾（neutral loss filtering，NLF）[12]和分子網絡策略（molecular networking，MN）[13]等。其中，MWⅠ策略僅需將MS1的質荷比信息與已知化合物質譜數據庫中數值匹配，即可快速篩選到目標化合物[14]，能夠用于活心丸中已知的有毒且有效的二萜生物堿及蟾蜍二烯酸內酯類成分的定性分析。

因此，本研究通過檢索PubMed、MassBank 等數據庫及相關文獻，分別構建源于蟾酥和附子的蟾蜍二烯酸內酯和二萜生物堿類化合物的內部數據庫，采用UPLC-Q-TOF-MS 分析活心丸樣品，建立MWⅠ后處理策略，快速甄別數據庫中已知成分的質譜信號，并結合質譜裂解途徑，鑒定其中蟾蜍二烯酸內酯和二萜生物堿類化合物，以期為活心丸的質量控制和臨床使用提供依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD 系列高效液相色譜（日本島津公司）串聯Triple TOF 6600+型高分辨質譜儀（美國Sciex公司）；ME204 5424 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；UP2200H型超聲波清洗器（南京壘君達超聲電子設備公司）；5424R 型離心機（德國艾本德公司）；Milli-Q 型超純水系統（美國密理博公司）。

1.2 試藥

6批活心丸樣品（批號分別為1190001、1190002、1190003、1170001、1170002、1170003）由廣州白云山醫藥集團股份有限公司白云山制藥總廠藥物研究所提供，樣本存放于北京中醫藥大學中藥現代研究中心。

對照品蟾毒靈（批號：DT210830-022）、蟾毒它靈（批號：DST200811-079）、酯蟾毒配基（批號：DST200816-063）和華蟾毒精（批號：DST200205-005）均購自成都德思特生物技術有限公司；新烏頭堿（批號：2614/12516）、次烏頭堿（批號：2615/12516）、苯甲酰新烏頭原堿（批號：2316/12313）和苯甲酰次烏頭原堿（批號：2317/12312）均購自上海詩丹德生物科技有限公司。以上對照品經高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）檢測，純度均大于98%。

質譜級甲酸和乙腈（美國Thermo-Fisher 公司）；去離子水為實驗室自制超純水（18.2 MΩ?cm）；分析純甲醇（北京化工廠有限責任公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1對照品溶液的制備 取各對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成對照品儲備液。精準吸取各對照品適量，分別用甲醇稀釋成質量濃度為10 μg·mL-1的對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 稱取各批次活心丸樣品適量，分別置于研缽中研磨粉碎，過二號篩，得到活心丸粉末。精密稱取各批粉末樣品10 mg于1.5 mL離心管中，加入甲醇0.5 mL 超聲提取30 min，隨后在12 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為5 cm），等量吸取各批次上清液，混合均勻，即得供試品溶液。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析條件

Capcell Core ADME 色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），流速為0.2 mL?min-1；梯度洗脫（0～5.0 min，5%～17%B；5.0～7.0 min，17%～35%B；7.0～27.0 min，35%～55%B；27.0～30.0 min，55%～95%B；30.0～30.1 min，95%～5%B；30.1～34.0 min，5%B）；柱溫為35 °C；進樣量為2 μL。

Triple TOF 6600+型質譜儀配備電噴霧離子源（ESⅠ），正離子模式采集，源參數設置如下：氣簾氣（CUR）壓力為35 psi（1 psi=6.895 kPa），霧化氣（GS1）壓力為55 psi，輔助氣（GS2）壓力為55 psi，噴霧電壓（ⅠS）為5500 V；離子化溫度（TEM）為550 °C。采用實時動態背景扣除（DBS）和數據依賴型采集模式（ⅠDA）采集MS2，MS1及MS2采集范圍均為m/z50～1000，碰撞能量（CE）為40 eV，碰撞能擴展值（CES）為±20 eV。使用PeakView? 1.2（美國Sciex 公司）進行后續色譜峰提取和識別等數據處理。

2.3 數據后處理

2.3.1蟾蜍二烯酸內酯和二萜生物堿類化合物數據庫的構建 基于文獻[15-20]已報道的分別來源于蟾酥和附子的蟾蜍二烯酸內酯和二萜生物堿類化合物，以 及 ChemSpider（http://www.chemspider.com）、HMDB（https://hmdb.ca）、PubChem（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、SciFinder（https://scifinder.cas.org/scifinder）和Chemical Book（https://www.chemicalbook.com/ProductⅠndex.aspx）數據庫中信息，建立了包括蟾蜍二烯酸內酯和二萜生物堿類化合物名稱、結構、分子式、準分子離子（[M+H]+）的質荷比和碎片離子信息的內部數據庫。

2.3.2建立MWⅠ篩選方法 使用PeakView? 1.2軟件提取活心丸的一級總離子流（TⅠC）圖，導出有效洗脫時間（1.0～30.0 min）內且響應閾值高于0.1%的MS1質譜數據。以采集的MS1質荷比的整數部分作為X軸，小數部分作為Y軸，將質譜數據導入GraphPad Prism 7.0 軟件繪制活心丸MS1數據的二維散點圖。同理，參照內部數據庫中化合物準分子離子的質荷比信息，且小數部分允許誤差范圍為±0.005，繪制已知的蟾蜍二烯酸內酯和二萜生物堿類化合物的二維散點圖。

3 結果

3.1 基于MWⅠ的蟾蜍二烯酸內酯與二萜生物堿的快速篩選

通過查閱蟾酥與附子化學成分相關文獻，結合開源化合物數據庫中的化合物信息，最終建立囊括165 個化合物的內部數據庫，其中蟾蜍二烯酸內酯類化合物59 個，二萜生物堿類化合物106 個。由于這2 類化合物存在同分異構體，其準分子離子的質荷比相同，MWⅠ信號無法區分，故已知化合物的二維散點圖中包含98 個分子量印跡信號（圖1A）。其中27個蟾蜍二烯酸內酯類（藍色）及71個二萜生物堿類（綠色）化合物。

圖1 基于分子量印跡技術的二維散點圖

采用UPLC-Q-TOF-MS 分析活心丸樣品，得到MS1TⅠC圖（圖2）。選取保留時間1.0～30.0 min內的11 442 個質譜信號，建立活心丸MS1數據二維散點圖（圖1B）。

圖2 活心丸UPLC-Q-TOF-MS一級TIC圖

將活心丸的二維散點圖與已知化合物的二維散點圖重疊，在98 個目標分子量印跡信號±0.005 的誤差范圍內，捕獲到活心丸MS1數據中485 個m/z[M+H]+信號（圖1C）。由于一個化合物的色譜峰寬內會采集到多個MS1信號，以色譜峰峰寬（0.11～0.20 min）及保留時間，過濾掉采集到的tRMS1數據中同一色譜峰中的重復的MS1信號，最終共篩選到內部數據庫中80 個已知化合物，包括47個蟾蜍二烯酸內酯類和33 個二萜生物堿類化合物，詳細信息見表1。

表1 活心丸中蟾蜍二烯酸內酯及二萜生物堿類化學成分的鑒定結果

續表1

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3.2 蟾蜍二烯酸內酯類化合物的結構鑒定及質譜裂解途徑

基于MWⅠ策略，從活心丸中初步篩選得到來源于蟾酥的47 個蟾蜍二烯酸內酯類化合物，其中包括蟾毒配基類化合物38 個（化合物19、21～23、26～28、31、34、36、38、39、41～43、46、50、51、53、56、58、59、61、62、64～70、72、74、76～80）和脂肪酸氨基酸酯類蟾蜍毒素9 個（化合物29、32、37、45、47、52、60、73、75）。經對照品比對，準確鑒定了其中4 個蟾毒配基類化合物（蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾毒精和酯蟾毒配基，分別為化合物68、76、77和78）。通過對以上4個對照品的質譜數據進行分析（表2），并結合文獻研究，總結和歸納了該類化合物的裂解規律。在正離子模式下，準分子離子通常以[M+H]+的形式存在，結構中多存在羥基取代，前體離子會中性丟失水分子（H2O，m/z18.010 6）生成[M+H-H2O]+等相應碎片離子。其中蟾毒配基類C17位不飽和內酯環可能發生裂解，中性丟 失H2O 和CO（m/z27.994 9），產 生[M+H-2H2O]+、[M+H-2H2O-CO]+等碎片離子[15-17]。化合物C16位存在乙酰基取代時，如蟾毒它靈、華蟾毒精等，酯鍵易發生斷裂，中性丟失乙酸分子（CH3COOH，m/z60.021 1），產生[M+H-CH3COOH]+、[M+HCH3COOH-H2O]+和[M+H-CH3COOH-H2O-CO]+等碎片離子。此外，C17位還可以丟失六元不飽和內酯 環（C5H4O2，m/z96.021 1），產 生[M+H -C5H4O2]+等碎片離子。蟾蜍毒素類化合物母核C3位與酸成酯，且篩選到的9 個脂肪酸氨基酸酯類蟾蜍毒素均可斷裂酯鍵，產生相應的辛二酰精氨酸（m/z331.198 1）、己二酰精氨酸（m/z303.166 8）或丁二酰精氨酸（m/z275.135 5）等特征性碎片離子。

表2 蟾毒配基類和二萜生物堿類化合物對照品高分辨質譜信息

以蟾毒配基類化合物26（tR=10.59 min）為例，對蟾蜍二烯酸內酯類化合物進行結構鑒定。在正離子模式下，MS1圖譜顯示其準分子離子峰[M+H]+為m/z403.248 0，預測其分子式為C24H34O5（誤差為0.2×10-6），可能為內部數據庫中蟾毒配基類化合物遠華蟾毒精（telocinobufagin）或其同分異構體。MS2圖譜中主要檢測到的碎片離子為m/z385.239 2、367.228 6、349.217 4、339.232 1、321.220 4、271.206 5和253.196 1（圖3A），推測準分子離子分別中性丟失1、2、3 分子的H2O 產生碎片離子m/z385.239 2[M+H-H2O]+、367.228 6[M+H-2H2O]+和349.217 4[M+H-3H2O]+，碎片離子m/z367.228 6和349.217 4 繼而碎裂C17位不飽和內酯環，脫去羰基（CO）分別產生碎片離子m/z339.232 1[M+H-2H2O-CO]+和321.220 4[M+H-3H2O-CO]+；m/z367.228 6 和349.217 4 也可失去C17位不飽和內酯環（C5H4O2），生成m/z271.206 5[M+H-2H2O-C5H4O2]+和253.196 1[M+H-3H2O-C5H4O2]+（圖3B）。根據質譜裂解途徑的推斷及碎片離子歸屬，并與內部數據庫中MS2信息比對，該化合物可能為遠華蟾毒精或其同分異構體。

圖3 遠華蟾毒精的二級質譜圖及質譜裂解途徑

3.3 二萜生物堿類化合物的結構鑒定及質譜裂解途徑

從活心丸中初步篩選到來源于附子的33 個二萜生物堿類化合物，包括C19 型二萜生物堿29 個，其中7 個雙酯型（化合物40、44、49、54、57、63、71），11 個單酯型（化合物16～18、20、24、25、30、33、35、48、55），11 個醇胺型（化合物1～6、8～11、13），C20 型二萜生物堿1 個（化合物7），以及其他型二萜生物堿3 個（化合物12、14、15）。經對照品比對，準確鑒定了其中4 個二萜生物堿類化合物（苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿和次烏頭堿，分別為化合物25、35、49、63）。分析以上4個對照品的質譜數據（表2），并結合文獻研究，總結和歸納了該類化合物的裂解規律。二萜生物堿母核結構上均有甲氧基和羥基取代，常以中性丟失H2O 和CH3OH 為主要裂解方式，產生[M+H-H2O-CH3OH]+和[M+H-CH3OH]+等碎片離子[18-19]。新烏頭堿和次烏頭堿等雙酯型生物堿相比于單酯型生物堿在C8位有乙酰基取代，能夠特征性地丟失CH3COOH，產生[M+H-CH3COOH]+、[M+HCH3COOH-CH3OH]+等碎片離子；而苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿等單酯型生物堿的C8位無乙酰基取代，常中性丟失CH3OH 和H2O，產生[M+H-H2O-2CH3OH]+、[M+H-2CH3OH]+等碎片離子。雖然雙酯型與單酯型二萜生物堿在C14位有苯甲酰基取代，但C14位苯甲酰基不容易丟失[20]。此外，醇胺型生物堿C8位無乙酰基取代且C14位無苯甲酰基取代，常以中性丟失CH3OH 和H2O 為主要裂解方式。因此，C19 型二萜生物堿的質譜裂解規律基本相似。

以C19型醇胺型二萜生物堿化合物3（tR=6.39 min）為例鑒定其結構。正離子模式下其準分子離子峰[M+H]+為m/z486.268 6，預測其分子式為C24H39NO9（誤差為-2.4×10-6），經MWⅠ篩選后可知化合物3可能為新烏頭原堿（mesaconine）。MS2圖譜中主要碎片離子有m/z468.257 5、454.239 2、436.233 6、422.233 6、404.205 5 和372.177 5（圖4A）。準分子離子可中性丟失H2O 生成碎片離子m/z468.257 5[M+H-H2O]+，繼而脫去1個分子和2個分子CH3OH分別產生碎片離子m/z436.233 6[M+H-H2OCH3OH]+和404.205 5[M+H-H2O-2CH3OH]+；準分子離子也可直接丟失1分子和2分子CH3OH，分別產生碎片離子m/z454.239 2[M+H-CH3OH]+和422.233 6[M+H-2CH3OH]+，m/z422.233 6可相繼脫去CH3OH和H2O 產生碎片離子m/z372.177 5[M+H-H2O-3CH3OH]+（圖4B）。該化合物的MS2信息與內部數據庫中新烏頭原堿的碎片離子一致，且通過質譜裂解途徑推斷結構，鑒定該化合物為新烏頭原堿。

圖4 新烏頭胺的二級質譜圖及質譜裂解途徑

4 討論

活心丸化學成分復雜，處方蟾酥中的蟾蜍二烯酸內酯和附子中二萜生物堿類既是藥效成分也為潛在的毒性成分，為保證活心丸的安全性及有效性，快速表征其化學組成能夠為活心丸質量控制及藥效物質的闡明提供依據。本研究采用UPLC-Q-TOFMS，采集活心丸樣品完整的質譜信息，建立MWⅠ后處理策略，利用所構建的蟾蜍二烯酸內酯類和二萜生物堿類化合物數據庫，快速甄別已知蟾蜍二烯酸內酯類化合物47 個，二萜生物堿類化合物33 個，結合分子式預測、質譜裂解途徑及碎片離子歸屬，鑒定篩選化合物結構。由于活心丸處方以附子的炮制品黑順片入藥，炮制后附子毒性成分雙酯型生物堿水解，含量顯著降低，故從樣品中僅篩選到7 個雙酯型二萜生物堿，其余26 個為單酯型及醇胺型二萜生物堿。鮮蟾酥中主要成分為蟾蜍毒素類化合物，而活心丸制劑中入藥為干蟾酥，鮮蟾酥在高溫炮制后蟾蜍毒素類化合物大部分會分解為蟾毒配基類化合物，故在活心丸中檢出大量蟾毒配基類化合物，僅篩選到已知的9個蟾蜍毒素類化合物，均為脂肪酸氨基酸酯類。因此，單酯型、醇胺型二萜生物堿及蟾毒配基類化合物能夠作為質量控制指標性成分，用于全面評價活心丸質量，確保其安全有效。

活心丸化學成分復雜，UPLC-Q-TOF-MS 能夠快速全面地采集其化學成分信息，但質譜數據集的解析工作尤為繁重，尤其是從大量數據中選擇性篩查某一類成分時，需要借助后處理策略才能實現。本研究針對其中入藥量較低的蟾酥與附子，建立蟾蜍二烯酸內酯和二萜生物堿類成分數據庫，且利用MWⅠ策略，能夠有效地過濾掉大量的冗雜信息。活心丸中二萜生物堿結構含有1 個氮原子，精確分子量的整數部分為偶數，而蟾蜍二烯酸內酯類化合物不含或含有偶數個氮原子，精確分子量的整數部分為奇數，在建立MWⅠ方法時，針對分子量特點，不僅能通過MS1質譜信號快速匹配已知成分，而且在鑒定過程中也能夠對成分來源進行區分。由于二萜生物堿類和蟾蜍二烯酸內酯類結構中羥基等取代基位置不同，各類化合物的同分異構體較多，雖然色譜能夠對同分異構體實現一定程度的分離，但在缺乏對照品的情況下，僅通過MWⅠ篩選與碎片離子歸屬，尚不能精準鑒定和區分同分異構體的結構。保留時間能夠反映化合物的極性，進而反映其結構信息，因此，后期可建立定量結構保留關系（QSRR）[21]，尋找這2 類化學成分的結構與在反相色譜中保留時間的關系，準確指認同分異構體的色譜峰。也可通過在線能量分辨質譜策略（online ERMS）[22]，建立裂解所需碰撞能與結構中化學鍵鍵能的相關性，辨別同分異構體結構。

在常用的質譜數據后處理技術中，DFⅠF 和MN等基于二級碎片離子信息挖掘目標及未知化學成分。DFⅠF 能夠篩查到具有相同診斷離子的結構類似物，以診斷離子進行印跡篩選，類似于本研究基于一級離子的MWⅠ策略。UNⅠFⅠ天然產物解析平臺廣泛用于復雜天然產物樣品的成分鑒定工作中[23]，該平臺雖目前只能用于解析Waters Q-TOF 的質譜數據，但其快速鑒定的實質也是將MWⅠ及DFⅠF 策略應用到自動解析過程中，對數據與軟件數據庫中化合物的一級和二級信息進行印跡篩選。MN 基于二級質譜碎片的相似度建立化學成分可視化的網絡圖譜，從而推斷未知化合物信息，能夠與本研究的MWⅠ篩選已知化合物的方法相結合，提高基于質譜技術鑒定天然產物的能力與效率。

綜上分析，本研究為快速篩選中藥等復雜基質中已知成分提供了思路和方法，也為進一步研究活心丸的藥效物質及臨床安全使用提供了依據。