肉蓯蓉延緩衰老功能因子及作用機制研究△

宋紫騰，李瑩曼，徐旭，韓彥琪，張鐵軍*，許浚，4*

1.天津藥物研究院 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300301；

2.天津藥物研究院 釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300301；

3.天津中醫藥大學，天津 301617；

4.中國中藥協會 藥食同源物質評價和利用專業委員會，北京 100061

肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 為我國傳統名貴中藥材，被譽為“沙漠人參”，始載于《神農本草經》，列屬上品。其味甘、咸，性溫，歸腎、大腸經，中醫認為其具有補腎陽、益精血、潤腸通便之效[1]。2018 年，肉蓯蓉（荒漠）被列入《按照傳統既是食品又是中藥材物質目錄》中[2]，將其開發為保健產品的價值得到了認可。據統計，肉蓯蓉在抗衰老延年類方劑中的出現頻率僅次于人參[3]。現代藥理研究表明，肉蓯蓉具有顯著的抗氧化、延緩衰老、抗疲勞、改善記憶力等多方面作用[4]，但其延緩衰老的功能因子及作用機制尚不明確。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，以下簡稱線蟲）是一種多細胞生物，遺傳背景清楚、壽命相對較短、繁殖快、易培養，且隨壽命的增長表現出與人類相似的衰老表型。線蟲基因、蛋白、信號通路都與人類高度保守，與人類基因的同源性達60%～80%。近年來，線蟲在中藥及天然藥物抗衰老的研究中已得到廣泛應用[5]。本研究采用網絡藥理學方法預測肉蓯蓉延緩衰老的活性成分、靶點和信號通路；以線蟲為模式生物，通過觀察其壽命、生殖等整體指標，測定其氧化應激、運動能力的變化及與壽命相關基因的表達情況，探索肉蓯蓉延緩衰老的作用機制，為相關健康產品的開發及應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

SMZ-168 型體視顯微鏡（Motic 公司）；CKX41型倒置相差熒光顯微鏡（Olympus 公司）；Multiskan FC型酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司）；Mycycler 型聚合酶鏈式反應（PCR）基因擴增儀、MJ Mini?型熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

肉蓯蓉采收自新疆于田縣荒漠肉蓯蓉良好農業規范（GAP）種植基地，經天津藥物研究院有限公司張鐵軍研究員鑒定為肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma；2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFHDA）、2% NaN3（Sigma 公司）；Trizol 試劑、cDNA合成試劑盒、SYBR Green Kit（Takara 生物工程有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化酶（GSHPx）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；熒光定量聚合酶鏈式反應（qRTPCR）所需引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 線蟲

實驗所用10 種不同基因類型的線蟲均來源于Caenorhabditis Genetics Center，具體信息見表2。

表2 線蟲品系及基因型

2 方法

2.1 肉蓯蓉功能因子和靶點的篩選

通過查閱文獻并結合本課題組前期對肉蓯蓉物質組的表征，從中篩選出主要化學成分及入血成分[6-9]。在ChemDraw 19.0 軟件中繪制化合物結構，將其輸入到SwissTargetPrediction 數據庫（http://new.swisstargetprediction.ch/），采用反向藥效團匹配方法得到虛擬篩選結果。同時利用中藥系統藥理數據庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）。使用UniProt數據庫（http://www.uniprot.org/）中的UniProtKB 搜索功能及Reviewed Swiss-Prot對蛋白進行過濾，并限定物種為“human”，將化合物靶標蛋白矯正為基因名。整合2 個數據庫靶點結果，得到化合物潛在作用靶點庫。

2.2 衰老相關靶點的預測分析

使用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMⅠM（https://omim.org/）數據庫，以“old、senile、decrepit、senescence、feeble、caducity”為關鍵詞進行檢索，其中GeneCards 篩選得分≥10%的基因，將2 個數據庫的結果合并，剔除重復基因，最終得到衰老相關靶點。再將2.1項下功能因子作用靶點與上述衰老相關靶點合并，取交集，繪制韋恩圖。

2.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPⅠ）網絡的構建

將得到的交集靶點輸入到STRⅠNG 11.5（http://string-db.org/）數據平臺，將物種限定為“Homo sapiens”，交互得分最高置信度為0.900，獲得PPⅠ網絡。將數據保存為.TSV 格式，導入Cytoscope 3.8.0 軟件，以度（degree）值調整節點大小和顏色深淺，獲得肉蓯蓉活性成分與疾病靶點的PPⅠ網絡。選取度、介數（betweenness）、緊密度（closeness）3 個參數均大于中位數的點作為核心靶點，經篩選共得到8個核心靶點。

2.4 基因本體（GO）生物分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

采用OmicsBean數據庫（http://www.omicsbean.cn/login/），對交集靶點進行GO 功能分析和KEGG通路富集分析，依據P值進行排序，并對得到的通路進行分析。

2.5 藥材-成分-靶點-通路網絡構建

將藥材、成分、靶點、通路導入Cytoscope 3.8.0軟件，構建肉蓯蓉藥材-成分-靶點-通路網絡。

2.6 線蟲培養

線蟲在20 ℃條件下，使用NGM 培養基（雙蒸水250 mL 中含有NaCl 0.750 g、胰蛋白胨0.625 g和瓊脂4.250 g）進行恒溫培養。滅菌大腸埃希菌E.coliOP50（65 ℃，45 min）作為食物來源，均勻涂布于NGM 培養基表面。使用裂解液（5% NaClO，5 mol·L-1NaOH）進行線蟲同期化處理，同期化后的線蟲在20 ℃培養箱中培養至L4 期。隨機挑取L4期線蟲，分為對照組（NGM 培養基）、不同質量濃度肉蓯蓉給藥組進行實驗。

2.7 藥物制備

取肉蓯蓉藥材10 g，按照料液比1∶10 加入蒸餾水，回流提取2 次，每次2 h，合并水提液，濾過后減壓濃縮至干。用滅菌蒸餾水配制成質量濃度為50 mg·mL-1（以生藥量計）的母液。用NGM 培養基分別配制成終質量濃度為0、25、50、75、100、200、500 μg·mL-1的溶液，備用。

2.8 毒性實驗

將N2線蟲轉移到含有不同質量濃度肉蓯蓉（0、25、50、100、200、500 μg·mL-1）的培養皿中，每組100條。給藥當天計為第0天，每天換新鮮含藥培養基并記錄線蟲死亡情況，得到肉蓯蓉的安全給藥劑量范圍。

2.9 應激實驗

將N2線蟲轉移到含有不同質量濃度肉蓯蓉（0、25、50、75 μg·mL-1）的培養皿中，每組100 條。給藥當天計為第0 天，每天換新鮮含藥培養基，給藥第7 天進行應激實驗。氧化應激實驗中，將各組線蟲轉移至NGM 培養基（每10 mL NGM 培養基中添加30% H2O210 μL）中，每30 min 記錄線蟲存活情況。熱應激實驗中，將線蟲持續暴露在35 ℃條件下培養，每2 h記錄線蟲存活情況。

2.10 身體彎曲實驗

取N2 線蟲，分組及給藥處理同2.9項下。給藥第3 天和第7 天進行身體彎曲實驗，取每組20 條線蟲，對30 s內線蟲身體彎曲的次數進行檢測記錄。

2.11 咽泵實驗

取N2 線蟲，分組及給藥處理同2.9項下，每個培養皿中各放1 條線蟲，每個質量濃度設置5 個平行，給藥第0、3、7 天在體式顯微鏡下觀察線蟲吞咽頻率，每次跟蹤觀察60 s并記錄其咽泵次數。

2.12 繁殖實驗

取L1 期N2 線蟲置于給藥培養基中培養至L4 期后，每天轉移至新的不同質量濃度含藥培養基中，并對線蟲的產卵量進行測定，將含卵的舊板置于20 ℃培養48 h 后進行子代數量的測定。每個培養皿中含有1條線蟲，每個質量濃度設置5個平行。

2.13 脂褐素積累測定

取N2 線蟲，分組及給藥處理同2.9項下，每組100 條線蟲。給藥第7 天及第11 天進行脂褐素測定實驗，隨機選35 條線蟲置于2%瓊脂糖片上，用2%NaN3麻醉，使用熒光顯微鏡（激發光波長為360～370 nm，發射光波長為420～460 nm）觀察線蟲體內的藍色自發熒光，并使用ⅠmageJ 1.51 軟件量化熒光強度。

2.14 MDA、ROS含量及抗氧化酶活性測定

取N2 線蟲，分組及給藥處理同2.9項下，每組100條線蟲。給藥第7天，將每組培養基上的線蟲用0.9%氯化鈉溶液沖洗并收集于1.5 mL 離心管內，置于冰上勻漿，轉速3000 r·min-1離心10 min（離心半徑42.5 mm），離心后取上清液，用試劑盒分別測定SOD、CAT、GSH-Px的活性及MDA含量。

ROS 測定實驗中，使用M9 緩沖液沖洗線蟲3 次，置于終濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA 溶液中37 ℃黑暗孵育20 min，每5 min 搖勻1 次。隨后用M9緩沖液清洗2次，將線蟲置于載玻片上。使用熒光顯微鏡（激發光波長485 nm，發射光波長為520 nm）拍照，并使用ⅠmageJ 1.51 軟件評估相對熒光強度。

2.15 衰變加速因子-16（DAF-16）、SKN-1 的核易位及SOD-3、谷胱甘肽S 轉移酶-4（GST-4）、熱休克蛋白-16.2（HSP-16.2）的可視化

分別采用TJ356、LG333 轉基因線蟲進行DAF-16、SKN-1 蛋白核易位實驗。分別采用CF1553、CL2166、TJ375 轉基因線蟲確定SOD-3、GST-4 和HSP-16.2 蛋白的表達情況。分組與給藥處理同2.9項下。給藥第7 天使用熒光顯微鏡對各組線蟲拍照，使用ⅠmageJ 1.51 軟件對GFP 熒光強度進行量化。

2.16 突變體線蟲壽命測定

分別采用CF1038、EU1、PS3551、DA1116 線蟲進行實驗，分為對照組和肉蓯蓉75 μg·mL-1給藥組。每天統計各組線蟲的存活率。

2.17 qRT-PCR實驗

將L4 期N2 線蟲轉移至含有不同質量濃度肉蓯蓉（0、25、50、75 μg·mL-1）的NGM培養基（含150 μmol·L-1五氟尿嘧啶），20 ℃培養6 d。采用Trizol 法提取線蟲總RNA，逆轉錄成cDNA 用于mRNA 定量。使用2-△△Ct法處理數據，act-1作為內參基因。

2.18 數據分析

3 結果

3.1 肉蓯蓉潛在活性成分和作用靶點

通過查閱文獻并結合本課題組前期研究，選取了包括苯乙醇苷類、環烯醚萜類和木脂素類等12 個化學成分作為網絡藥理學研究的目標化合物，具體信息見表3。從數據庫中經去除重復后得到12 個潛在活性成分的作用靶點共86個。

表3 肉蓯蓉活性成分

3.2 衰老相關靶點

在GeneCards、OMⅠM 數據庫分別收集到7753、295個與衰老相關的靶點。

3.3 藥物與疾病共同靶點及PPⅠ網絡構建

藥物靶點與疾病靶點取交集得到75 個交集靶點，導入STRⅠNG 網絡分析平臺，隱去網絡中未連接的節點，構建PPⅠ網絡，見增強出版材料。該PPⅠ網絡中共有45個節點、59條連線。經拓撲學分析篩選出8個核心靶點，見表4。

表4 肉蓯蓉延緩衰老核心靶點

3.4 GO富集分析和KEGG富集分析

通過OmicsBean數據庫，將核心靶點進行GO功能富集和KEGG 通路分析。GO 分析包含細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物過程（biological process）3個方面，P值最小的前10 個條目見增強出版材料。結果表明，生物過程主要涉及到調節活性氧代謝過程、免疫反應正調節、蛋白質定位到細胞器、多糖消化過程等；細胞組分主要包括內膜系統、胞外區、質膜、膜結合細胞器、細胞外分泌體、高爾基體等；分子功能主要與葡萄糖苷酶活性、一氧化氮合酶調節活性、碳水化合物結合、β-果糖呋喃糖苷酶活性等有關。KEGG 共富集篩選得到27條衰老相關通路，將前20條通路繪制通路氣泡圖（見增強出版材料），肉蓯蓉延緩衰老主要涉及到癌癥通路、神經分泌系統及信號傳導通路。癌癥通路主要包括前列腺癌（prostate cancer）、乳腺癌（breast cancer）等通路；神經內分泌系統涉及雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、促性腺激素釋放素信號通路（GnRH signaling pathway）、胰島素信號通路（insulin signaling pathway）等；信號傳導通路有磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PⅠ3KAkt）信號通路和磷脂酶D 信號通路（phospholipase D signaling pathway）。

3.5 藥材-成分-靶點-通路網絡構建

通過Cytoscape 3.8.0 軟件將肉蓯蓉延緩衰老的活性成分、靶點、通路映射到藥材-成分-靶點-通路網絡中。該網絡中共有114 個節點、218 條線（見增強出版材料）。

3.6 肉蓯蓉對線蟲壽命的影響

毒性實驗結果如圖1 所示，與對照組比較，肉蓯蓉25、50 μg·mL-1可延長線蟲壽命，100 μg·mL-1無明顯效果，200、500 μg·mL-1對線蟲具有一定毒性，縮短了線蟲的壽命。根據毒性實驗結果，選擇肉蓯蓉給藥質量濃度為25、50、75、100 μg·mL-1，測定N2 線蟲壽命。結果如表5 所示，與對照組比較，肉蓯蓉25、50、75 μg·mL-1組線蟲壽命顯著延長，因此以25、50、75 μg·mL-1進行后續實驗。

表5 不同質量濃度肉蓯蓉對線蟲壽命的影響（,n=100）

表5 不同質量濃度肉蓯蓉對線蟲壽命的影響（,n=100）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

圖1 不同質量濃度肉蓯蓉給藥后線蟲的生存曲線

3.7 肉蓯蓉對線蟲應激能力的影響

在H2O2誘導的氧化應激條件下，與對照組比較，肉蓯蓉處理組線蟲壽命延長（圖2A），其中對照組線蟲平均壽命為（1.44±0.07）h，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲平均壽命為（2.02±0.05）h，壽命顯著延長（P＜0.001）。在熱應激條件下，與對照組比較，肉蓯蓉處理組線蟲的抗熱休克能力提升，壽命延長（圖2B），其中對照組線蟲平均壽命為（19.25±0.20）h，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲平均壽命為（22.80±0.08）h，與對照組比較壽命延長作用顯著（P＜0.001）。

圖2 應激條件下肉蓯蓉對線蟲壽命的影響

3.8 肉蓯蓉對線蟲脂褐素積累和身體彎曲能力的影響

脂褐素會隨著年齡的增加而逐漸積累。與對照組比較，肉蓯蓉25、50、75 μg·mL-1組線蟲在第7天藍色熒光水平分別降低了15.09%、28.67%、39.86%（圖3A～B）；在第11 天藍色熒光水平則分別降低了8.55%、22.36%、36.84%，表明肉蓯蓉抑制了脂褐素的積累。

肉蓯蓉對線蟲身體彎曲能力的影響如圖3C 所示，與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲在第3 天和第7 天30 s 內身體彎曲次數分別增加了25%、36.17%，表明肉蓯蓉可促進線蟲身體彎曲。

圖3 肉蓯蓉對線蟲衰老色素積累及運動能力的影響

3.9 肉蓯蓉對線蟲吞咽能力及繁殖能力的影響

在第3天和第7天，與對照組比較，肉蓯蓉給藥組線蟲咽部泵送率（60 s 內咽泵次數）差異無統計學意義（圖4A），表明肉蓯蓉并沒有改變N2 線蟲的食物攝入量，肉蓯蓉介導的長壽作用并不依賴于飲食限制。給藥處理線蟲產卵量（圖4B）和子代數（圖4C）與對照組相比無明顯變化，表明肉蓯蓉并未對線蟲的繁殖能力產生影響。

圖4 肉蓯蓉對線蟲吞咽能力及繁殖能力的影響（,n=5）

3.10 肉蓯蓉對ROS、MDA含量及抗氧化酶活性的影響

急性應激毒性會導致ROS 水平的升高。如圖5A、5B 所示，與對照組比較，給藥第7 天肉蓯蓉組線蟲ROS 積累水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。為探究肉蓯蓉對線蟲內源性抗氧化防御能力的影響，測定了線蟲體內抗氧化酶的活性。與對照組比較，肉蓯蓉25、50、75 μg·mL-1組線蟲SOD、CAT、GSH-Px 活性顯著升高（圖5C～E）。MDA 是脂質過氧化的重要生物標志物，與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲體內MDA 水平顯著降低（P＜0.05，圖5F）。以上結果表明，肉蓯蓉可以有效緩解線蟲的氧化應激。

圖5 肉蓯蓉對線蟲ROS、MDA含量及抗氧化酶活性的影響（,n=100）

3.11 肉蓯蓉對衰老相關基因mRNA表達的影響

KEGG 分析前20 條通路中的胰島素（ⅠⅠS）信號通路與線蟲衰老密切相關，且機制研究相對較成熟[10]，因此驗證了胰島素信號通路上與衰老相關基因的表達。線蟲體內釋放的胰島素樣肽（ⅠLPs）與其受體DAF-2 結合后激活晚期糖基化終末產物-1（AGE-1），進一步激活蛋白激酶B-1/2（Akt-1/2），使得轉錄因子DAF-16 磷酸化，導致DAF-16 活性及其向細胞核遷移的行為受到抑制[11]。如圖6所示，與對照組 比 較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組 線 蟲DAF-2、AGE-1、Akt-1 mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），DAF-16 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01）。表明肉蓯蓉介導的延壽作用依賴于ⅠⅠS 信號通路。sir-2.1基因在線蟲衰老、應激及凋亡等生理活動中均具有重要的作用，上調sir-2.1基因的表達會延長線蟲的壽命[12]，但給藥處理后并未顯著改變SⅠR-2.1 mRNA 的表達水平（圖6）。HSF-1、SKN-1對線蟲的氧化應激和衰老起重要調控作用[11]。結果表明，與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲HSF-1、HSP-16.1、HSP-16.2、SKN-1 mRNA 表達水平顯著提高（圖6）。

轉錄因子DAF-16/叉頭盒蛋白（FOXO）和SKN-1/核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）被激活，可調節許多編碼抗氧化相關蛋白的基因[13]。與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲SOD-3、GST-4、CTL-1、CTL-2、MTL-1 mRNA 的表達水平顯著上調，表明肉蓯蓉可能通過增強抗氧化能力來延長壽命。飲食限制法能夠通過限制食物攝入來改善線粒體功能，延長壽命[14]。各組線蟲EAT-2 mRNA 的表達差異無統計學意義，表明肉蓯蓉介導的延壽作用并不通過飲食限制途徑（圖6）。

圖6 肉蓯蓉對衰老相關基因mRNA表達的影響（,n=100）

3.12 肉蓯蓉對相關基因突變體線蟲壽命的影響

與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組daf-16、skn-1、hsf-1基因突變體線蟲在給藥處理后壽命曲線并未發生顯著右移（圖7A～C），而eat-2基因突變體線蟲平均壽命增加了16.45%（P＜0.001，圖7D）。結果表明，肉蓯蓉介導的延壽作用與daf-16、hsf-1和skn-1基因相關，但與eat-2基因無關。

圖7 肉蓯蓉對衰老相關轉基因突變體線蟲壽命的影響

3.13 肉蓯蓉對DAF-16、SKN-1蛋白核易位的影響

DAF-16蛋白分別在細胞質、細胞間和細胞核中表達的代表性圖片見圖8A。與對照組比較，肉蓯蓉給藥后線蟲體內DAF-16蛋白在細胞核定位比例顯著升高，細胞質定位比例顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，圖8C）。SKN-1 蛋白分別在細胞質、細胞核表達的代表性圖片見圖8B。與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲體內SKN-1 蛋白在細胞質定位比例顯著降低，細胞核定位比例顯著升高（P＜0.05，圖8D）。

圖8 肉蓯蓉對DAF-16和SKN-1從細胞質向細胞核易位的影響

3.14 肉蓯蓉對線蟲SOD-3、GST-4、HSP-16.2 蛋白表達的影響

利用CF1553、CL2166 和TJ375 轉基因線蟲分別對SOD-3、GST-4 和HSP-16.2 蛋白表達水平進行可視化和定量（圖9）。與對照組比較，肉蓯蓉各質量濃度組線蟲SOD-3、GST-4 蛋白表達水平均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。肉蓯蓉50、75 μg·mL-1組線蟲HSP-16.2 蛋白表達水平顯著提高（P＜0.01，P＜0.001）。

圖9 肉蓯蓉對線蟲SOD-3、GST-4和HSP-16.2蛋白表達的影響

4 討論

隨著我國人口老齡化程度加劇，探究抗衰老機制并開發延緩衰老的健康產品至關重要。中藥具有不良反應小、整體均衡調節的優勢，在抗衰老研究中發揮著獨特的作用[15]。衰老屬中醫“虛勞”范疇，與五臟內傷密切相關，其根本原因是腎氣虧虛、腎精不固，病位主要在腎，與脾胃虛衰關系密切。腎為先天之本，脾為后天之本，因此中醫認為通過補脾益腎可以起到延年益壽、防病抗衰老的作用[16]。隨著現代醫學的發展，針對衰老機制的相關研究日益增多，出現了自由基學說、端粒學說、DNA 損傷修復學說、免疫衰老學說、內分泌學說等，其中自由基學說受到廣泛認可[17]。中醫指出，腎虛的本質涉及多個衰老學說。腎虛患者體內存在自由基損傷且身體免疫功能紊亂，同時還存在神經內分泌功能失調。可見，腎虛實質涉及自由基損傷學說、免疫功能下降學說和神經內分泌功能失調學說等關于衰老的機制。多項研究表明，抗衰老中藥可通過提高體內抗氧化酶活性、清除過剩的ROS 抑制氧化應激反應，保護細胞免受氧化損傷，達到延緩衰老的目的[18-19]。

肉蓯蓉歸腎經，功效為補腎陽、益精血，《神農本草經疏》 記載：“肉蓯蓉為滋腎補精血之要藥”[20]。目前對肉蓯蓉延緩衰老的研究多集中在糖類、苯乙醇苷類成分對D-半乳糖致衰老大鼠模型的保護作用。其中肉蓯蓉多糖主要是通過抗氧化、改善學習記憶力、增強免疫功能和端粒酶活性等起到延緩衰老作用；肉蓯蓉總苷主要通過抗氧化、減少腦損傷和調節機體免疫力等功能起作用；苯乙醇苷類物質中的松果菊苷可通過ROS 信號通路、飲食限制信號通路和胰島素/胰島素樣生長因子信號通路延長線蟲的壽命[21]。肉蓯蓉延緩衰老的功能已經得到證實，但其作用機制研究尚不充分。

本研究中網絡藥理學結果表明，紅景天苷和6-去氧梓醇可能通過作用于ⅠⅠS 通路上的HRAS、HK2和甲狀腺激素通路上的HRAS、ESR1，共同調節線粒體功能、減少胰島素抵抗，進而發揮延緩衰老作用[22]；有報道稱抑制Ras/Raf/MEK/ERK 和Ras/PⅠ3K/PTEN/Akt/mTOR 途徑可以延緩細胞衰老[23]，毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷F、異毛蕊花糖苷、2′-乙酰毛蕊花糖苷、連翹脂素葡萄糖苷、紅景天苷可能作用于HSP90AA1、ESR1 共 同 調 節PⅠ3K/Akt/mTOR[24-25]，紅景天苷可能通過作用于HRAS 調節PⅠ3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK 和Ras/PⅠ3K/PTEN/Akt/mTOR[23]，2′-乙酰毛蕊花糖苷可作用于F2 調節MMP-2[26]，松果菊苷、毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷F、異毛蕊花糖苷、2′-乙酰毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷A、紅景天苷與MMP2 結合，從而調節c-Raf/MEK/ERK和ERK/MAPK 通路[27]，以上化合物均可能通過抑制癌癥信號通路從而延緩衰老；磷脂酶D（PLD）下調可刺激人體細胞中ROS 的積累從而加速細胞衰老，這被廣泛認為在衰老中起重要作用，紅景天苷和2′-乙酰毛蕊花糖苷可能分別作用于HRAS 和F2，通過激活RAS、cAMP 通路共同上調PLD，從而降低ROS 的堆積延緩衰老[28]。以上結果顯示HRAS 基因在抗衰老相關信號通路中發揮了重要作用，且KEGG 通路分析顯示，HRAS 是人類壽命相關信號通路ⅠGF-1/PⅠ3K/Akt/FoxO 中的一個關鍵基因，為后續利用線蟲進行體內實驗驗證提供了依據。

衰老的自由基學說表明，氧化應激機制是導致人體衰老的重要機制，也是當前中藥延緩衰老的研究重點[29-30]。正常情況下，機體體內自由基處于平衡狀態，抗氧化防御系統一旦遭到破壞，產生的過量ROS 使氧化還原反應處于漸進氧化狀態，導致脂質過氧化，攻擊細胞膜、DNA 和蛋白質，導致其變性、損傷，加速衰老及相關疾病的發生[31]。本研究結果表明，肉蓯蓉能明顯提高線蟲體內抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px 的活力并降低ROS 的水平和MDA 的積累，進而改善過氧化氫導致的氧化應激，此外還能有效緩解線蟲的熱應激，顯著抑制脂褐素的積累并增強線蟲的身體彎曲能力，延長其壽命。

線蟲的ⅠⅠS信號通路與其生長、發育、壽命及代謝息息相關，是第一個被研究出與衰老相關的信號通路[32]，且與人類壽命ⅠGF-1/PⅠ3K/Akt/FOXO 通路同源[33]。線蟲體內的胰島素信號受體為DAF-2，位于細胞膜上。當活性物質激活DAF-2 受體時，可以使PⅠ3K的同源物AGE-1活化，AGE-1產生的第二信使可以促使下游的Akt 被激活，進而磷酸化轉錄因子DAF-16。磷酸化的DAF-16 不能進入細胞核發揮轉錄調節功能。因此抑制DAF-2，其對DAF-16的負調控作用解除，DAF-16進入細胞核發揮轉錄調節功能，并與細胞核中的其他因子相互作用，包括SⅠR-2.1、HSF-1 和SKN-1，使得線蟲壽命延長[34]。線蟲Nrf家族轉錄因子SKN-1是機體對氧化應激反應的重要組成部分。ⅠⅠS 信號轉導通路可直接抑制SKN-1，這一過程與DAF-16類似，ⅠⅠS通路上的Akt-1、Akt-2和SGK-1 都可以通過磷酸化SKN-1 進而抑制SKN-1的活性[35]。線蟲體內實驗研究結果表明，肉蓯蓉可以通過下調ⅠⅠS 通路，即降低daf-2、age-1和akt-1基因的表達水平，從而降低DAF-16 及SKN-1 的磷酸化水平，并促進其核易位，進而上調下游抗氧化相關蛋白基因與熱休克相關基因的表達水平，最終使線蟲延長壽命，減緩衰老。

綜上，本研究以肉蓯蓉中潛在功能因子為研究對象，應用網絡藥理學解析藥材-成分-靶點-通路的復雜網絡關系，分析得到其延緩衰老可能的作用靶點和通路，根據預測結果進一步利用線蟲體內實驗驗證肉蓯蓉延緩衰老的作用機制，結果表明肉蓯蓉能明顯延長線蟲壽命，抑制衰老色素積累并改善線蟲因衰老引起的運動能力下降，通過增強線蟲抗氧化系統有效抵抗熱應激及氧化應激造成的自由基損傷。肉蓯蓉介導的延壽作用機制可能是通過ⅠⅠS信號通路下調daf-2，age-1，上調daf-16及其下游靶基因（sod-3、mtl-1、gst-4、ctl-1和ctl-2），同時激活skn-1和熱休克相關基因（hsf-1、hsp-16.1和hsp-16.2）的表達來實現的。