保健保本草菁萃安全性評價及對小鼠免疫功能影響研究

寧德山，梁峰，趙宏偉，3*，程江，王磊，尹麗華，葉小敏

1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510520；

2.廣州暨南生物醫藥研究開發基地有限公司，廣東 廣州 510632；

3.中國中藥協會 藥食同源物質評價和利用專業委員會，北京 100061；

4.武漢藥品醫療器械檢驗所，湖北 武漢 430075

隨著人們生活節奏的加快，多種因素導致越來越多的人處于亞健康狀態[1-3]，這是一種處于健康和疾病之間的一種生理狀態，免疫力下降是其主要特征之一[4-6]。據世界衛生組織一項全球性的研究預測，全球有75%的人群處于亞健康狀態，而中國保健學會2022 年7 月對中國16 個百萬以上人口的城市居民抽樣調查顯示，亞健康狀態的人群達總人口數的70%以上[7-8]。中醫自古就有“治未病”理念，亞健康狀態就處于易病未病的狀態，與傳統中醫藥的未病先防理論不謀而合。多種中草藥具有免疫調節功能，其中以真菌類和補益類藥食同源中藥居多，成分以多糖類為主。據文獻報道，枸杞子[9-10]、茯苓[11-12]、香菇[13-14]、桑 椹[15-16]、菊花[17-18]、黨 參[19-20]、猴 頭菇[21-22]、金 針菇[23-24]、銀耳[25-26]等中草藥均具有免疫調節作用，其活性成分諸如多糖、生物堿等參與機體特異性免疫和非特異性免疫過程，具有不良反應少、不易產生耐藥性、多靶點作用等特點。保健保本草菁萃是以上述天然中草藥為原料，經過不同的組方配比篩選出的復方保健食品，在前期的研究中，本課題組已經建立了制劑工藝和質量標準，然而其如何發揮功效尚不明確，長期使用的安全性也有待驗證。本研究依據《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003版）[27]有關要求，對保健保本草菁萃的安全性和增強免疫功能進行評價，以期為其應用提供可靠的數據支持。

1 材料

1.1 實驗動物、菌株和細胞

無特定病原體（SPF）級昆明種小鼠20 只，體質量18～22 g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002，用于急性經口毒性實驗。

SPF 級SD 大鼠88 只，體質量75～90 g，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，用于30 d喂養實驗。

SPF 級近交系雄性Balb/C 小鼠120 只，體質量18～22 g，由南方醫科大學動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2016-0041，用于免疫功能評價實驗。

實驗動物房為屏障系統，環境溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，人工照明12 h 晝夜更替。實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2014-0077，使用證明號：00270497。動物實驗經武漢藥品醫療器械檢驗所實驗動物倫理委員會審批，符合實驗動物倫理學要求。

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102，批號分別為5281D、5282D、5249D、5280D，購自上?？党缮锟萍加邢薰?，-80 ℃保存，經生物學特性鑒定合格后用于實驗。

小鼠淋巴瘤細胞YAC-1 為暨南大學細胞生物學系實驗室自傳代，支原體檢測為陰性。

1.2 試藥

保健保本草菁萃由無限極（中國）有限公司提供（批號：Q1611019），為棕黃色粉劑，實驗前用蒸餾水現配成各質量濃度。

敵克松（批號：SLBC6145V）、2-氨基笏（2-AF，批號：20100526）、二甲基亞砜（DMSO，批號：D8418）均購于Sigma 公司；疊氮化鈉（NaN3，批號：S8200，Amresco 公司）；1,8-二羥基蒽醌（批號：C1706017，Aladdin 公司）；代謝活化系統用大鼠肝S9（批號：3772，Moltox公司）；RPMⅠ 1640細胞培養液（批號：11875093，賽默飛世爾公司）；刀豆蛋白A（ConA，批號：C8110）、4%多聚甲醛（批號：P1110）、吉姆薩染液（批號：G1015）、補體（豚鼠血清，批號：S4990）、綿羊紅細胞（SRBC，批號：S9450）、雞紅細胞（批號：S9454）均購自北京索萊寶科技有限公司；2,4-二硝基氟苯（DNFB，批號：F830061，上海麥克林生化科技有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒（批號：C0016）、胎牛血清（批號：C0228）均購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 儀器

PB 302 型電子天平（梅特勒-托利多公司）；BS 110S 型電子天平 [賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；SW-CJ-1F 型標準型凈化工作臺（蘇州吳江華夏空調凈化設備廠）；LT-BⅠX300L 型低溫生化培養箱 [立德泰勀（上海）科學儀器有限公司]；H-1850R 型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）；TS-110X50 型恒溫搖床（上海天呈科技有限公司）；XT-2000i 型全自動動物血液細胞分析儀（希森美康公司）；BS-820 型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；ASP200S 型真空組織脫水機、EG1150 型包埋機、EG1150C 型包埋冷凍臺、RM2265 型全自動切片機、HⅠ1210 型攤片機、HⅠ1220型烤片機均購自Leica Biosystems Nussloch GmbH 公司；DM2500 型顯微照相儀（Leica Microsystems 公司）；Elx800 型酶標儀（Bio-Tek 公司）；UV-2600 型分光光度計（Shimadzu公司）；YA28X6T/8型高壓滅菌鍋（寧波甬安醫療器械制造有限公司）；DK-24 型恒溫水浴鍋、DHG-9053A 型鼓風干燥箱均購自上海精宏實驗設備有限公司；ECLⅠPSE-TⅠ2 型倒置顯微鏡（尼康儀器有限公司）；PHS-3C 型pH 計（成都世紀方舟科技有限公司）；ⅠM1200型全自動細胞計數儀 [艾力特生物科技（上海）有限公司]。

2 方法

2.1 保健保本草菁萃的制備

將檢驗合格的枸杞子、茯苓、香菇、桑椹、菊花、黨參、金針菇、猴頭菇和銀耳藥材去除雜質，按質量比10∶10∶10∶10∶5∶5∶5∶3∶2 稱量并投入提取罐內，加入12 倍量的水煎煮提取2.5 h，濾過后收集濾液，濾渣重新加10 倍量的水煎煮2 h，收集濾液，合并2 次濾液，旋轉蒸發濃縮至固形物質量分數為（35±5）%。濃縮液加入40 份的菊粉，攪拌均勻后投入真空帶式干燥機，干燥物料經粉碎后過100目篩，即得保健保本草菁萃粉劑。

2.2 急性經口毒性實驗

稱取受試物25.89 g，用純水定容至40 mL，得到能通過小鼠灌胃器的最大質量濃度0.65 g·mL-1的供試液。取SPF 級昆明種小鼠20 只，雌雄各半，適應性飼養3 d，禁食16 h后按20 mL·kg-1灌胃給予上述供試液，每日3 次（間隔4 h），1 日內總劑量為38.83 g·kg-1，相當于人攝入量的1177倍（以每日口服2 g、體質量60 kg 計，折算劑量為0.033 g·kg-1）。連續觀察灌胃后4 h 內和14 d 內毒性反應、存活情況。對死亡動物作大體解剖[28]。

2.3 Ames實驗（平板滲入法）

取鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102 菌株，采用平板滲入法進行實驗。在加和不加S9 活化系統條件下，受試物設5000、1000、200、40、8 μg/皿5個劑量組，另設二甲基亞砜（DMSO）溶劑對照、自發回變對照和陽性對照。陽性對照采用敵克松、NaN3、2-AF、1,8-二羥基蒽醌，劑量分別為50.0、2.5、10.0、50.0 μg/皿。每組3個平行，37 ℃培養48 h，計算平均回變菌落數。在加或不加S9 活化系統條件下，1株以上的菌回變菌落數≥溶劑對照組回變菌落數的2倍，并呈劑量-效應關系，或1 個以上劑量具有可重復的并具有統計學意義的陽性結果，可判斷該受試物細菌回復突變實驗結果陽性。陰性結果需至少做2次測試，陽性結果至少做3次測試[29]。

2.4 30 d喂養實驗

取SPF級SD大鼠88只，按體質量隨機分為4組，每組雌雄各11 只。受試物高、中、低劑量組灌胃劑量分別為3.30、1.65、0.83 g·kg-1·d-1，相當于人體推薦量的100、50、25倍，同時設對照組，給予等量蒸餾水。各組每天灌胃1次，連續30 d。每天觀察并記錄大鼠的行為、體征、呼吸、中毒癥狀和死亡狀況；每周稱1次體質量、2次食物攝入量，按照公式（1）計算每周食物利用率。實驗末期，將大鼠禁食不禁水16 h，腹主動脈采血測定血液學指標及血生化指標丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（GLU）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、總膽固醇（TCHO）、三酰甘油（TG），計算ALB/球蛋白比值（ALB/GⅠO）。然后將大鼠脫頸椎處死，大體解剖后肉眼觀察有無明顯病變，取肝、腎、脾、性器官等臟器進行稱量，計算臟體比，并對肝、腎、脾、胃腸、性器官等臟器進行組織病理學檢查[30]。

2.5 免疫功能評價實驗

選用SPF 級近交系雄性Balb/C 小鼠120 只，體質量18～22 g，適應性飼養1 周，按體質量隨機分為12 組，每組10 只，其中4 組用于脾淋巴細胞轉化實驗和自然殺傷（NK）細胞活性測定，4 組用于遲發型變態反應實驗，4 組用于抗體生成細胞檢測和腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗。受試物低、中、高劑量組分別灌胃0.17、0.33、1.00 g·kg-1·d-1，相當于人體推薦量的5、10、30 倍，對照組給予等量蒸餾水。連續灌胃30 d后，各組小鼠根據檢測指標方法進行相應處理取樣。飼養期間自由飲食，每周稱量記錄體質量1次，并根據體質量變化調整給藥量[27]。

2.5.1脾淋巴細胞轉化實驗 小鼠給予受試物30 d后，無菌取脾臟，Hank's 液中放置，用鑷子將脾臟剪碎研磨，制成單個細胞懸液，過200 目篩網濾過，Hank's液清洗2 次，每次離心10 min（1000 r·min-1，離心半徑6 cm），然后將細胞懸液懸浮于完全培養基，臺盼藍染色計算活細胞數后調整細胞密度為3×106個/mL。將每份細胞懸液加入24 孔培養板中，每孔1 mL，設2 個復孔，1 孔加入ConA 溶液（終質量濃度為7.5 μg·mL-1）作為實驗孔，另1 孔作為空白。細胞培養箱內37 ℃孵育培養72 h。噻唑藍（MTT）法在波長570 nm 下檢測每孔的吸光度（A），用實驗組A減去空白孔A代表淋巴細胞的增殖能力，受試物組細胞的增殖能力顯著高于對照組，判定該項實驗結果陽性。

2.5.2耳腫脹法檢測遲發型變態反應（DTH）小鼠給予受試物30 d 后，腹部脫毛約3 cm×3 cm，用10 mg·mL-1DNFB 溶液50 μL 均勻涂抹致敏。5 d后，用DNFB 溶液10 μL 均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊，攻擊后24 h 頸椎脫臼處死，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm 的耳片，稱定質量。用左右耳片質量之差表示DTH 的程度，受試物組的質量差值顯著高于與對照組的質量差值，可判定該項實驗結果陽性。

2.5.3抗體生成細胞檢測（改良法）小鼠給予受試物30 d 后，腹腔注射2%的SRBC 懸液0.2 mL 進行免疫，4 d后小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，制備為5×106CFU·mL-1細胞懸液。胎牛血清經綿羊紅細胞（5∶1）吸收，4 ℃，30～60 min 后加入不完全培養基RPMⅠ 1640 中，制備成含20%胎牛血清的完全培養基。將底層培養基（1.4%瓊脂糖）融化后，傾入6 孔板，凝固后于37 ℃備用。將頂層培養基（0.7%瓊脂糖）融化后，分裝小試管，每管0.5 mL，50 ℃水浴保溫，再向管內加20% SRBC 50 μL、脾細胞懸液200 μL，迅速混勻傾倒于6孔板中并鋪平頂層混合液，每個樣本做2個平行孔。待凝固后，放入37 ℃、5% CO2培養箱中孵育1 h，每孔加入以完全培養基稀釋的補體（1∶10）500 μL，繼續孵育2 h，計數1×106個脾細胞的溶血空斑數。受試物組空斑數顯著高于對照組空斑數，可判定實驗結果陽性。

2.5.4小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗 小鼠給予受試物30 d后，腹腔注射2% SRBC懸液0.2 mL進行免疫，4 d后小鼠頸椎脫臼處死，腹腔注射加胎牛血清的Hank's 溶液4 mL，輕按揉腹部20 次，充分洗出腹腔巨噬細胞。腹腔壁剪開一個小口，用膠頭吸管吸取腹腔洗液2 mL。用加樣器吸取0.5 mL腹腔洗液加入到含1%雞紅細胞懸液0.5 mL 的試管內，混勻。吸取混合液0.5 mL 加到24 孔板，置于細胞培養箱內孵育20 min，孵育結束后迅速用0.9%氯化鈉溶液將未貼壁的細胞洗掉，4%多聚甲醛溶液固定1 min，吉姆薩染色液染色15 min。沖洗，晾干，用40×顯微鏡計數巨噬細胞和被吞噬的雞紅細胞數，按公式（2）～（3）計算吞噬率和吞噬指數。受試物組吞噬率、吞噬指數與對照組吞噬率、吞噬指數比較，差異有統計學意義，可判定實驗結果陽性。

2.5.5NK 細胞活性測定 實驗前將靶細胞YAC-1進行傳代培養，用RPMⅠ 1640 完全培養液調整細胞濃度為4×105個/mL，備用。小鼠給予受試物30 d后，頸椎脫臼處死，無菌取脾臟，制備2×107個/mL脾細胞懸液。取靶細胞和效應細胞各100 μL [效應細胞-靶細胞（50∶1）] 加入到96 孔培養板內，作為反應孔。靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各100 μL，靶細胞最大稀釋孔加靶細胞和1% NP40 各100 μL。各實驗組均設3個復孔，細胞培養箱培養4 h，然后將培養板進行低速離心5 min（1000 r·min-1，離心半徑6 cm），每孔吸取上清液100 μL 轉至96 孔培養板內。利用LDH 檢測試劑盒，490 nm 檢測每孔的A。按照公式（4）計算細胞活性。受試物組的NK 細胞活性顯著高于對照組的NK 細胞活性，即可判定該項實驗結果陽性。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 急性經口毒性實驗

實驗觀察期內大鼠行動自如、飲食正常、精神狀態良好，未見明顯中毒癥狀，也無死亡，表明保健保本草菁萃劑量在38.83 g·kg-1·d-1時無毒性。

3.2 Ames實驗

4 個菌株在加和不加S9 活化系統條件下，受試物各劑量組的回變菌落數均未超過自發回變組和溶劑對照組回變菌落數的2 倍，亦無劑量-反應關系，因此判定保健保本草菁萃Ames實驗結果陰性，沒有致突變作用。2次重復實驗結果見表1～2。

表1 保健保本草菁萃第1次Ames實驗回變菌落數（,n=3）

表1 保健保本草菁萃第1次Ames實驗回變菌落數（,n=3）

表2 保健保本草菁萃第2次Ames實驗回變菌落數（,n=3）

表2 保健保本草菁萃第2次Ames實驗回變菌落數（,n=3）

3.3 30 d喂養實驗

3.3.1一般狀況觀察 實驗期內各組動物行為表現正常，無死亡和中毒癥狀。受試物各劑量組大鼠體質量與對照組差異無統計學意義（表3）。受試物各劑量組大鼠每周食物利用率與對照組比較，差異均無統計學意義（表4)。

表3 保健保本草菁萃對大鼠體質量的影響（,n=11）

表3 保健保本草菁萃對大鼠體質量的影響（,n=11）

表4 保健保本草菁萃對大鼠食物利用率的影響（,n=11）

表4 保健保本草菁萃對大鼠食物利用率的影響（,n=11）

3.3.2血液學指標 實驗末期，采血檢測主要血液學指標，各項指標均在正常范圍內。受試物各劑量組大鼠白細胞計數及分類、紅細胞計數、血紅蛋白濃度與對照組相比差異均無統計學意義，結果見表5。

表5 保健保本草菁萃對大鼠血液學指標的影響（,n=11）

表5 保健保本草菁萃對大鼠血液學指標的影響（,n=11）

3.3.3血液生化學指標 由表6 可以看出，受試物1.65、0.83 g·kg-1劑量組尿素氮水平與對照組差異有統計學意義，但這些差異的劑量效應關系不明顯，屬正常生理范圍內的波動，無毒理學意義；其余指標差異均無統計學意義。

表6 保健保本草菁萃對大鼠血液生化學指標的影響（,n=11）

表6 保健保本草菁萃對大鼠血液生化學指標的影響（,n=11）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3.4臟器質量和臟體比 由表7～8 可得，受試物各劑量組大鼠肝臟、腎臟、脾臟、卵巢（雌性）、睪丸（雄性）的臟器質量和臟體比與對照組比較差異均無統計學意義。

表7 保健保本草菁萃對大鼠臟器質量的影響（,n=11）

表7 保健保本草菁萃對大鼠臟器質量的影響（,n=11）

3.3.5大體解剖及病理組織學檢查 實驗結束后，解剖各組大鼠，肉眼觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃腸等主要臟器未見明顯病變。取大鼠各臟器做病理組織學切片檢查，結果發現對照組1 只大鼠腸黏膜輕度水腫，其他組織均未見明顯病理變化；受試物3.30 g·kg-1劑量組1 只大鼠肝組織內淋巴細胞局灶性增生，肝組織輕微淤血，肝細胞輕微脂肪變性，胃黏膜局灶性變性壞死脫落，黏膜下淤血，腸黏膜上皮細胞變性壞死脫落，腸絨毛鈍化縮短，其余大鼠各臟器未見明顯病理變化。

表8 保健保本草菁萃對大鼠臟體比的影響（,n=11）

表8 保健保本草菁萃對大鼠臟體比的影響（,n=11）

各組均只有個別大鼠出現病理變化，且病變性質和程度無明顯差異，所有病變類型在大鼠中為常見的自發性病理改變，無明顯生物學意義。

3.4 免疫功能評價實驗

3.4.1脾淋巴細胞轉化實驗 由圖1 可知，經口給予小鼠不同劑量受試物30 d 后，與對照組比較，受試物低劑量組對ConA 誘導淋巴細胞轉化差異無統計學意義，中、高劑量組對ConA 誘導淋巴細胞轉化差異有統計學意義（P＜0.01）。結果表明受試物中、高劑量能明顯促進ConA誘導的淋巴細胞轉化。

圖1 保健保本草菁萃對ConA誘導淋巴細胞轉化的影響（,n=10）

3.4.2遲發型變態反應 對照組、受試物各劑量（1.00、0.33、0.17 g·kg-1）組大鼠左右耳質量差分別為（17.09±3.49）、（14.54±2.11）、（14.41±2.00）、（15.65±3.81）mg，與對照組比較，受試物各劑量組大鼠左右耳質量差值差異均無統計學意義。結果表明受試物各劑量對大鼠DTH 程度沒有明顯影響。

3.4.3抗體生成細胞檢測 由圖2 可知，經口給予小鼠不同劑量受試物30 d 后，與陰性對照組相比，受試物低、中劑量組空斑數差異無統計學意義，高劑量組空斑數顯著增多（P＜0.01）。結果表明，受試物低、中劑量組對抗體生成細胞水平沒有明顯影響，高劑量組能明顯提高抗體生成細胞水平。

圖2 保健保本草菁萃對抗體生成細胞的影響（,n=10）

3.4.4小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗 由圖3～4 可知，經口給予小鼠不同劑量受試物30 d 后，與對照組相比，受試物低、中劑量組細胞吞噬率及吞噬指數差異無統計學意義，高劑量組吞噬率和吞噬指數顯著升高（P＜0.01）。結果表明，受試物低、中劑量組對巨噬細胞吞噬能力沒有明顯影響，高劑量能明顯提高巨噬細胞吞噬能力。

圖3 保健保本草菁萃對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率的影響（,n=10）

圖4 保健保本草菁萃對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數的影響（,n=10）

3.4.5NK 細胞活性測定 由圖5 可知，經口給予小鼠不同劑量受試物30 d 后，與對照組相比，受試物低、中劑量組NK 細胞活性差異均無統計學意義，高劑量組NK 細胞活性顯著升高（P＜0.05）。結果表明受試物低、中劑量對NK 細胞活性沒有明顯影響，高劑量能明顯提高NK 細胞活性。

圖5 保健保本草菁萃對NK細胞活性的影響（,n=10）

4 討論

本研究采用小鼠急性經口毒性實驗、Ames實驗和大鼠30 d 喂養實驗對保健保本草菁萃進行毒理學安全性評價，結果表明受試物對小鼠急性經口最大耐受量（MTD）＞38.83 g·kg-1，根據《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003 版）急性毒性劑量分級標準得出，此受試物屬于無毒物質；受試物Ames實驗結果陰性，未顯示出致突變作用；30 d 喂養實驗中，受試物對大鼠生長發育、血液學、血液生化學、主要臟體比及組織病理學檢測均未產生不良影響。由此可見，保健保本草菁萃作為食品是安全可靠的。

機體免疫系統由非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫3 個方面組成，能夠識別和清除入侵人體的抗原成分、體內的衰老細胞、凋亡細胞及異常突變細胞等，從而保持機體內環境的相對穩定[31]。本研究采用正常動物模型，從細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能及NK 細胞活性4 個方面綜合評價保健保本草菁萃對小鼠免疫功能的影響。脾臟是機體免疫系統的主要免疫器官之一，由T 細胞和B 細胞組成。脾淋巴細胞增殖是細胞免疫功能最直接的指標。受試物中、高劑量能明顯促進ConA誘導淋巴細胞的轉化，能增強細胞免疫功能；外周血、肝臟、脾臟是NK 細胞常常存在的部位，NK 細胞可以清除病變細胞，延緩細胞的衰老，極大地提高機體免疫力。當機體受到感染后，NK細胞發生活化，產生細胞毒性作用。NK 細胞可以識別靶細胞，活化吞噬細胞，釋放殺傷介質，從而增強機體的免疫能力。研究結果表明，受試物高劑量可增強NK細胞活性；顯著提高抗體生成細胞水平，對體液免疫應答是有益的；顯著提高巨噬細胞吞噬能力，單核巨噬細胞為一種機體非特異性免疫的重要細胞，其吞噬能力是可用于反映機體非特異性免疫功能。

綜上所述，保健保本草菁萃可通過調節小鼠非特異性免疫、細胞免疫、體液免疫及NK 細胞活性，從而達到增強免疫力的作用；在毒性研究中未發現不良反應。