多指標權重分析法結合正交試驗優選醋五靈脂炮制工藝△

李玲，彭致鋮，嚴玉晶，鄺敏，林嘉明，蔡盛康，張正

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244

五靈脂為鼯鼠科動物復齒鼯鼠Trogopterus xanthipesMilne-Edwar 的干燥糞便[1]，始載于《開寶本草》，又名藥本、寒號蟲糞等。其主要成分有黃酮類、酚酸類、三萜類和核苷類等[2]，具有活血止痛、化瘀止血、消積解毒等作用，臨床常用于心腹血氣諸痛、經閉、產后血瘀疼痛、崩漏下血、蟲蛇咬傷等[3]。歷版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）及地方藥材標準記載五靈脂炮制方式多為醋炒。趙佳琛等[4]對五靈脂進行了本草考證，建議對經典名方“身痛逐瘀湯”中五靈脂進行醋炒。醋可引藥入肝，增強活血止痛的作用，降低毒性、矯臭矯味等。醋五靈脂炮制工藝多以“取凈五靈脂置鍋內，用文火加熱，微炒后噴淋米醋，炒至微干，有光澤時，取出晾干”描述[5-10]，缺乏詳細工藝參數，不利于醋五靈脂飲片質量控制。本研究以米醋用量、電炒鍋功率、炒制時間為影響因素設計L9（34）正交試驗[11]，以指紋圖譜的主成分分析（PCA）結果及外觀性狀為評價指標，采用綜合加權評分優選醋五靈脂的炮制工藝，為其規范炮制及質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XP26 型百萬分之一天平、ME204E 型萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AR852B+型紅外測溫儀（東莞萬創電子制品有限公司）；H22-X3型電陶爐（杭州九陽生活電器有限公司）；Milli-Q Direct 型超純水系統（德國默克股份有限公司）；DLSB-5/20B 型低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）。

1.2 試藥

實驗用五靈脂購自陜西省商洛市商州區寬樹坪鎮，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為鼯鼠科動物復齒鼯鼠Trogopterus xanthipesMilne-Edwar的干燥糞便。

對照品原兒茶酸（批號：110809-201906，純度：97.7%）、4-羥基苯甲酸（批號：101149-201903，純度：100.0%）、槲皮苷（批號：111538-202007，純度：93.5%）、穗花杉雙黃酮（批號：111902-201603，純度：97.7%）、苯甲酸（批號：100419-201703，純度：99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品扁柏雙黃酮（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：RFS-B0511808009，純度97.0%）；水為超純水；乙腈、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純；米醋佛山市海天調味食品股份有限公司。

2 方法

2.1 醋五靈脂指紋圖譜測定方法

2.1.1色譜條件 ACQUⅠTY UPLC HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；乙腈（A）-0.1%磷酸（B）梯度洗脫（0～25 min，5%～20%A；25～65 min，20%～60%A；65～68 min，60%～85%A；68～70 min，85%～5%A）；檢測波長：265 nm；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：2.0 μL。

2.1.2對照品溶液制備 取原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質量濃度分別為25.793、49.700、41.159、19.112、18.075、48.925 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.1.3供試品溶液制備 取醋五靈脂粉末（過三號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇50 mL，稱定質量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質量，用80%乙醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 方法學考察

2.2.1系統適用性試驗 取對照品溶液、供試品溶液、空白溶劑適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，在此條件下各組分得到良好分離，供試品溶液超高效液相色譜法（UPLC）圖在與對照品溶液UPLC 圖相應的保留時間處有相同的色譜峰，且陰性對照無干擾（圖1）。

圖1 醋五靈脂系統適用性試驗UPLC圖

2.2.2精密度試驗 精密吸取2.1.3項下供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續測定6次，以4-羥基苯甲酸為參照峰（S），各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0.03%～0.16%、0.25%～3.18%，表明儀器精密度好。

2.2.3重復性試驗 精密稱取同批次醋五靈脂飲片粉末6 份，按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定，以4-羥基苯甲酸為參照峰（S），各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.06%～0.31%、0.79%～2.85%，表明該方法重復性良好。

2.2.4穩定性試驗 取同一供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別于0、4、8、12、16、24 h進樣檢測，以4-羥基苯甲酸為參照峰（S），各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 分別為0.05%～0.23%、0.54%～2.77%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3 醋五靈脂炮制工藝正交試驗設計

結合《全國中藥炮制規范》1988 年版[5]確定醋五靈脂的炮制方法：取凈五靈脂100 g置鍋中，用文火加熱，微炒后噴淋米醋，炒至微干、有光澤時，取出晾干。通過多次預試驗并結合實際情況，選定電炒鍋功率（A）、米醋用量（B）、炒制時間（C）為考察因素，采用L9（34）進行正交試驗，五靈脂藥材編號為M，9 次正交試驗炮制飲片編號為M1～M9，因素水平見表1。

表1 醋五靈脂炮制工藝正交試驗考察因素與水平

2.4 評價方法

2.4.1PCA PCA是考察多個變量間相關性的一種多元統計方法，其利用降維思想，選出較少的幾個主成分來揭示多個變量之間的內部關系[12]。本研究以4-羥基苯甲酸為參照峰，其余特征峰的相對峰面積為變量[13]，采用SPSS 21.0 軟件進行PCA，根據主成分的特征值、貢獻率及碎石圖選出主成分。結合載荷矩陣及特征值，按公式（1）計算主成分得分（Gj）。

式中aj為主成分的特征向量，Xj為原始數據標準化值。

按公式（2）計算各主成分綜合得分（Kj）。

2.4.2加權綜合評分法 為全面客觀反映醋五靈脂質量，本研究對外觀性狀分值及指紋圖譜PCA 得分分別賦予權重系數，采用加權綜合評分法對各樣品進行評價。

外觀質量評價依據：《中國藥典》1995 年版至2020 年版正文均未收載五靈脂藥材，因此筆者參考《全國中藥炮制規范》1988 年版[5]對外觀形狀進行評價，對醋五靈脂的性狀以“表面灰褐色或焦褐色，稍有光澤，內面黃褐色或棕褐色。質輕松。略有醋氣。”為優，分別以醋五靈脂外表面顏色（H1）、內面顏色（H2）、表面光澤度（H3）、氣味（H4）進行評分，各25分，按公式（3）計算外觀性狀得分（Hi）。

具體評分標準見表2。由于五靈脂與醋五靈脂外觀顏色差異不大[5]，光澤度、氣味等性狀易受環境影響且外觀性狀評分主要憑借專家及同行的實踐經驗判斷，主觀性較強，權重不宜過高，故賦予外觀性狀評價權重為30%。

表2 醋五靈脂外觀性狀評分標準

內在質量評價依據：本研究建立的色譜條件共分離出醋五靈脂炮制品中9 個化學成分，其中包括主要酚酸類成分原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、苯甲酸。體外實驗表明，該組分在抗血小板凝聚、抑菌及鎮痛抗炎方面具有較強的生物活性[14]。其中還分離出黃酮類成分穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮、槲皮苷，黃酮類成分為醋五靈脂主要有效成分，具有抗炎鎮痛、抗病毒、抗血小板凝聚及改善功能性消化不良等作用[15]。對醋五靈脂指紋圖譜各色譜峰進行PCA，可集中表征各炮制品主要活性成分的整體變化情況，對醋五靈脂飲片質量控制具有重要意義，因此給予PCA結果權重比為70%。

按公式（4）計算加權綜合評分（Y）。

滿分為100 分。其中，H=Hj/Hmax，Hi為各外觀性狀得分，Hmax為外觀性狀得分最大值；K=Kj/Kmax，Kj為各主成分綜合得分，Kmax為主成分綜合分析得分最大值[16-17]。

2.4.3KMO 檢驗和Bartlett′s 球狀檢驗 KMO 檢驗統計量是用于比較變量間相關性和偏相關性的重要指標，取值為0～1。KMO 統計量越接近于1，變量間的相關性越強，偏相關性越弱，因子分析的效果越好；當KMO 統計量在0.5 以下時，則該數據不宜做PCA 或因子分析[18]。Bartlett′s 球狀檢驗用于檢驗相關陣中各變量間是否各自獨立，若檢驗結果中P＜0.05，則說明符合標準，數據呈球形分布，各個變量在一定程度上相互獨立[19]。

3 結果

3.1 指紋圖譜測定結果

按2.3項下方法炮制五靈脂，按2.1項下方法制備供試品溶液并測定指紋圖譜，各樣品指紋圖譜疊加圖見圖2。以4-羥基苯甲酸為S 峰，計算各特征峰相對峰面積的RSD，見表3。各試驗樣品相對峰面積的RSD為6.14%～22.13%。

表3 不同炮制工藝醋五靈脂樣品共有峰相對峰面積

圖2 醋五靈脂炮制樣品UPLC指紋圖譜疊加圖

3.2 KMO檢驗和Bartlett′s球狀檢驗結果

將各樣品特征峰檢驗值導入SPSS 21.0 軟件進行KMO 檢驗和Bartlett′s 球狀檢驗，KMO 檢驗值為0.674＞0.5，而Bartlett′s球形檢驗值為0＜0.05，說明各特征峰存在一定相關性，可進行PCA。

3.3 PCA結果

本研究采用SPSS 21.0 軟件進行PCA，因子載荷矩陣見表4，碎石圖見圖3。以特征值＞1并結合碎石圖連續陡峭部分分析，得到2 個主成分[20-21]，特征值分別為5.026、1.442，2 個主成分累積方差貢獻率為80.843%，可代表試驗數據大部分信息。根據載荷矩陣及特征值，計算得出2 個主成分的特征向量，將其與原始數據標準化相乘后，分別得到主成分得分。按公式（5）計算各主成分綜合得分。

圖3 醋五靈脂樣品PCA碎石圖

表4 醋五靈脂樣品PCA因子載荷矩陣

G1、G2分別為2 個主成分得分，系數為各成分的方差貢獻率。9次試驗PCA綜合評分見表5。

表5 不同炮制工藝醋五靈脂樣品PCA綜合評分

3.4 加權綜合評分結果

按照2.4項下外觀性狀評價方法對9組炮制飲片進行性狀評分，并結合PCA 結果，以2.4項下加權綜合評分法對醋五靈脂正交炮制試驗進行最終評分，正交試驗設計結果見表6，方差分析見表7。

表6 醋五靈脂L9（34）正交試驗結果及直觀分析

表7 醋五靈脂L9（34）正交試驗結果方差分析

由直觀分析可知，醋五靈脂炮制工藝影響因素影響程度由大到小為C＞A＞B，方差分析結果表明，炒制時間對醋五靈脂炮制試驗結果影響差異有統計學意義（P＜0.05），而電炒鍋功率和米醋用量對結果影響差異無統計學意義。綜合分析，確定醋五靈脂最佳炮制工藝為每100 g 五靈脂藥材加米醋量為10 g，電炒鍋功率為600 W，炒制時間為10 min。

3.5 米醋用量單因素對比試驗

為進一步驗證工藝的可靠性，分別采用5、10、15、20 g 米醋量進行炮制對比試驗。按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進行測定，計算樣品的綜合評分，結果見表8。在優選的電炒鍋功率及炒制時間條件下采用不同米醋量炮制，醋五靈脂飲片PCA 評分差異無統計學意義。用較少的米醋量炮制，醋五靈脂飲片未能達到完全的矯味矯臭效果，而加米醋量多則炒制時噴灑米醋時間長，最終炮制后飲片干爽度、光澤度稍差。

表8 醋五靈脂炮制米醋用量單因素對比試驗結果

3.6 驗證實驗

以優選的醋五靈脂炮制工藝平行制備3 份樣品。按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定，計算3份樣品的綜合評分，結果見表9。優選的醋五靈脂炮制工藝穩定可靠，重復性好。生五靈脂與優選醋五靈脂飲片見圖4。

圖4 生五靈脂與優選醋五靈脂飲片

表9 醋五靈脂炮制工藝驗證實驗結果

4 討論

4.1 指紋圖譜方法考察

本研究建立的色譜條件可有效分離醋五靈脂炮制品中9個化學成分，通過對照品指認出其中6個峰分別為原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮。本研究對不同柱溫（28、30、32 ℃）、不同的流速（0.28、0.30、0.32 mL·min-1）、不同比例的提取溶劑（乙醇、50%乙醇、80%乙醇、甲醇、50%甲醇、80%甲醇）、不同的提取方式（超聲、回流）及不同的提取時間（15、30、60 min）進行考察。最終確定上述最佳色譜條件。該方法分離度、專屬性、重復性良好，可用于醋五靈脂的質量控制。

4.2 炮制對五靈脂成分及功效的影響

五靈脂及醋五靈脂中主要成分為黃酮類、酚酸類等成分，兩類成分均具有抗炎鎮痛、抗病毒、抑制血小板凝聚等作用[15,22]，與五靈脂的活血止痛、化瘀止血、消積解毒功效具有相關性。對比五靈脂和醋五靈脂的指紋圖譜，醋炒后并無化學成分增加或消失。研究發現，五靈脂藥材及其炮制品中黃酮類成分峰面積占總峰面積的58.7%～72.0%，其中又以穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮峰面積最高。隨著電炒鍋功率增大、炒制溫度升高、受熱時間延長，黃酮類成分出現不同程度降低，而酚酸類成分及其余特征峰峰面積增大。

查閱歷代本草，清代以來五靈脂炮制方式多為醋炒。《藥性切用》中記載“破血生用，調血炒用，入肝醋炒”，說明醋制可引藥入肝；同時《傷寒溫疫條辨》中記載“酒浸行血，醋炒止血”，表明炒用有止血之功，即醋炒可增強五靈脂活血止痛、化瘀止血的功效[4]。閔凡印[23]指出，五靈脂醋炒后尿素含量降低，在保留原有成分情況下，可去除原藥異味。同時醋作為良好的有機溶媒，能增強藥物的溶解度從而使有效成分更易煎出，提高療效[24]。本研究優選的醋五靈脂炮制工藝，以醋五靈脂9 個共有峰的PCA 結果作為內在評價指標，保證了五靈脂原有的活血止痛、化瘀止血、消積解毒等功效，同時炮制的醋五靈脂內外觀顏色、光澤度較佳，無腥臭味，醋炒既可協同五靈脂的止血功效又達到了糞便類藥材矯味矯臭的目的。

4.3 醋五靈脂炮制工藝的適用性

目前，五靈脂相關炮制研究較少，炮制的依據相對單一。閔凡印[23]針對五靈脂炮制前后尿素和浸出物的變化進行探討；吳用瓊[25]根據患者服藥后胃中的受納舒適度、是否達到矯味矯臭的目的進行研究；而朱志飛等[26]通過單一指標成分原兒茶酸含量確定五靈脂炮制條件。《中國藥典》1995 年版至2020 年版正文均未收載五靈脂藥材，本研究參照《北京市中藥飲片炮制規范》2008 年版[27]文火范圍，待鍋溫升至80～120 ℃時開始炒制計時，最終醋五靈脂飲片出鍋溫度控制在108～135 ℃，可為醋五靈脂飲片規范炮制及產業化生產提供參考。建立的UPLC 指紋圖譜方法，確定了醋五靈脂樣品中9個共有峰并對其中6 個色譜峰進行指認，結合PCA 對飲片內在質量進行整體評價。同時選取較直觀的色澤、氣味等外觀性狀指標，通過眼觀、鼻聞等傳統中藥鑒別方法進行分析，彌補了單純以化學指標來判斷飲片質量的不足。

綜上，本研究建立的醋五靈脂炮制方法將現代理化方法與傳統炮制模式相結合，確定的炮制工藝方法重復性好，可為醋五靈脂飲片規范炮制及質量控制提供參考。