三七生藥粉乙醇滅菌工藝優化及不同滅菌方式對質量的影響△

崔琳琳，陳寧，曹玲，孫艷，杜崇民，金宗元，張育龍，李晨鵬，高艷紅*

1.魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；

2.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；

3.青島市即墨區中醫醫院，山東 青島 266200

三七為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根莖，具有散瘀止痛、消腫定痛的功效，臨床上主要用于治療咯血、吐血、跌撲腫痛等[1]。很多中成藥，如三七片、三七傷藥片/膠囊等含有的三七需要直接打粉入藥，中藥打粉入藥往往攜帶大量的微生物[2-3]。因此，生藥粉入藥前需要進行滅菌處理，使其微生物含量在《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版的限定范圍之內。目前，對三七滅菌工藝的研究大多為輻照滅菌[4-6]，雖然輻照滅菌效果理想，但其輻照劑量超標對身體產生的安全性問題一直存在爭議，消費者對經過輻照滅菌的產品存有安全疑慮[7-8]。張海江等[9]采用75%乙醇對三七進行滅菌，能很好地達到滅菌效果，但未對其他滅菌方式進行研究。

本研究以三七生藥粉為研究對象，以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1含量，皂苷總量和滅菌率的綜合評分為指標，采用響應面法優選三七乙醇滅菌工藝，同時與常規滅菌方法進行質量對比研究，對乙醇滅菌技術的優勢進行探討，為后續制劑開發及研究提供參考。

1 材料

2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XS105DU 型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；GZX-9240MBE 型電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；MQS0.6 型脈動真空滅菌柜（張家港市環宇制藥設備有限公司）。

三七（安國市聚藥堂藥業有限公司，批號：2110009），經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根莖；對照品人參皂苷Rg1（批號：110703-202034，純度：94.0%）、人參皂苷Rb1（批號：110704-202129，純度：96.0%）、三七皂苷R1（批號：110745-201820，純度：90.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均購自美國天地有限公司；磷酸（純度≥85.0%）、乙醇均購自南京化學試劑有限公司；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 三七生藥粉滅菌方法

2.1.1三七生藥粉制備 取三七，粉碎過四號篩，備用。

2.1.2滅菌樣品的制備 稱取三七生藥粉200 g，采用乙醇滅菌、濕熱滅菌、輻照滅菌、干熱滅菌方法制備三七生藥粉的滅菌樣品。濕熱滅菌：脈動真空滅菌柜115 ℃滅菌30 min，置于鼓風干燥機中，70 ℃下干燥3～4 h；干熱滅菌：烘箱160～170 ℃滅菌150 min；輻照滅菌：60Co 射線6 kGy 輻照滅菌；乙醇滅菌：75%乙醇浸潤，密閉3 h，放入鼓風干燥箱中，70 ℃下干燥3～4 h。

2.2 含量測定

2.2.1色譜條件Welch Ultimate?PG-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（B）-水（A）梯度洗脫（0～12 min，19%B；12～60 min，19%～36%B）；柱溫為30 ℃；檢測波長為203 nm；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷 Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1適量，加甲醇制成質量濃度分別為0.088 04、0.125 40、0.130 40 mg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.2.3供試品溶液的制備 參照《中國藥典》2020年版（一部）“三七”含量測定項下方法制備供試品溶液。

2.2.4線性關系考察 分別取2.2.2項下對照品溶液，三七皂苷R1質量濃度分別為0.088 0、0.176 1、0.440 2、0.880 5、1.320 6、1.760 8 mg·mL-1，人參皂苷Rg1質量濃度分別為0.152 4、0.304 8、0.762 0、1.524 0、2.286 1、3.048 2 mg·mL-1，人參皂苷Rb1質量濃度分別為0.130 4、0.260 8、0.652 3、1.304 2、1.956 8、2.608 1 mg·mL-1，注入液相色譜儀，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標（Y）、含量為橫坐標（X）繪制標準曲線，得人參皂苷Rg1回歸方程：Y=362 605X-5 805.6（r=0.999 8），人參皂苷Rb1回歸方程：Y=267 371X-4 729.1（r=0.999 4），三七皂苷R1回歸方程：Y=134 980.96X+6 110.72（r=0.999 2）。結果表明，人參皂苷Rg1在0.152 40～3.048 10 μg 線性關系良好，人參皂苷Rb1在0.130 40～2.608 20 μg 線性關系良好，三七皂苷R1在0.088 04～1.760 80 μg線性關系良好。

2.3 滅菌率測定

采用平板計數法對制備的樣品菌總數進行測定，該法出自《中國藥典》2020 年版（四部）1105 通則項下的非無菌產品微生物限度檢測法，按公式（1）、（2）計算滅菌率[10]。

2.4 層次分析法（AHP）確定權重系數

根據《中國藥典》2020年版對三七含量測定成分要求，對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量，三者皂苷總含量和滅菌率權重指標予以量化。將5個指標分為2個層次，確定5項指標的順序為皂苷總含量=滅菌率＞三七皂苷R1=人參皂苷Rg1=人參皂苷Rb1。構建的指標成對比較的判斷優先矩陣見表1。根據評分結果，AHP法計算得到三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三者皂苷總含量和滅菌率的權重系數分別為0.11、0.11、0.11、0.33、0.33，一致性比例因子（CR）=0＜0.1，指標優先比較判斷矩陣具有較好的一致性，權重系數有效。

表1 三七滅菌工藝權重層次分析指標成對比較的優先矩陣

2.5 乙醇滅菌工藝單因素試驗

2.5.1乙醇體積分數對綜合指標的影響 在乙醇用量25%、干燥溫度65 ℃、滅菌時間2 h 條件下，考察不同乙醇體積分數（45%、55%、65%、75%、85%、95%）對綜合評分的影響，結果見圖1。隨著乙醇體積分數的增加，綜合評分先增加后下降，其中乙醇用量對三七中皂苷含量影響較小，對滅菌率的影響較大，在乙醇體積分數75%條件下，滅菌率最高，因此選擇65%、75%、85% 乙醇做后續實驗。

圖1 乙醇體積分數對三七滅菌工藝綜合評分的影響（,n=6）

2.5.2乙醇用量對綜合指標的影響 在乙醇體積分數75%、干燥溫度65 ℃、滅菌時間2 h 條件下，考察不同乙醇用量（15%、20%、25%、30%、35%、40%）對綜合評分的影響，結果見圖2。隨著乙醇用量的增加，綜合評分先增加后緩慢下降，其中乙醇用量＞30%時，三七中皂苷含量出現降低趨勢，在乙醇用量25%條件下，滅菌率最高，隨著乙醇用量的增加，滅菌率基本不變，因此選擇20%、25%、30%的乙醇用量做后續實驗。

圖2 乙醇用量對三七滅菌工藝綜合評分的影響（,n=6）

2.5.3滅菌時間對綜合指標的影響 在乙醇體積分數75%、乙醇用量25%、干燥溫度65 ℃條件下，考察滅菌時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對綜合評分的影響，結果見圖3。隨著滅菌時間的增加，綜合評分先增加后趨于平緩，在2 h之前滅菌率隨著滅菌時間的增加而增加，2 h時滅菌率最高，2 h之后滅菌率基本不變，因此選擇1.5、2.0、2.5 h做后續實驗。

圖3 滅菌時間對三七滅菌工藝綜合評分的影響（,n=6）

2.5.4干燥溫度對綜合指標的影響 在乙醇體積分數75%、乙醇用量25%、滅菌時間2 h條件下，考察不同干燥溫度（45、55、65、75、85、95 ℃）對綜合評分的影響，結果見圖4。當干燥溫度低于85 ℃時，綜合評分變化不大，對皂苷含量和滅菌率的影響均較小，當干燥溫度＞85 ℃時，三七中皂苷的含量顯著下降，考慮到時間、成本等因素，因此選擇65、75、85 ℃做后續實驗。

圖4 干燥溫度對三七滅菌工藝綜合評分的影響（,n=6）

2.6 響應面法優化乙醇滅菌工藝

2.6.1方案設計及試驗結果 依據響應面試驗設計原理，結合單因素試驗結果，進行因素水平設計與試驗。因素水平見表2，設計及結果見表3～4。

表2 三七乙醇滅菌工藝響應面因素水平

表3 三七乙醇滅菌工藝響應面試驗設計及結果分析

2.6.2方差分析和擬合回歸方程 利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行二次多元回歸分析，響應值與各因素的回歸方程：Y=36.100-0.081A+0.037B+0.170C-0.076D-0.040AB-0.130AC+0.033AD+0.200BC+0.120BD-0.017CD-0.420A2-0.150B2-0.480C2-0.330D2，方差分析結果見表4。模型的F值為40.19、P值＜0.000 1，說明模型極顯著；失擬項P值為0.134 2，說明非試驗因素對試驗結果影響不大，模型成立。其中滅菌時間對綜合評分有極顯著影響，乙醇體積分數和干燥溫度對綜合評分影響差異有統計學意義，乙醇用量對綜合評分影響差異無統計學意義，二次項A2、B2、C2、D2均達到極顯著水平（P＜0.001）。各因素的影響順序為滅菌時間＞乙醇體積分數＞干燥溫度＞乙醇用量，交互作用的響應面和等高線圖見圖5～10。

圖5 乙醇體積分數和乙醇用量對三七滅菌工藝綜合評分的影響

表4 三七滅菌工藝響應面回歸模型方差分析

2.6.3驗證實驗 根據響應面模型和結果分析，得到三七粉最佳滅菌工藝為乙醇體積分數73.50%、乙醇用量26.47%、滅菌時間2.13 h、干燥溫度74.39 ℃，在此滅菌條件下綜合評分為36.137 3分。結合實際生產及可操作性，將滅菌條件調整為乙醇體積分數74%、乙醇用量26%、滅菌時間2.2 h，干燥溫度75 ℃，在此條件下進行3次驗證實驗，結果見表5。

由表5 可知，3 次驗證實驗平均綜合評分為36.19 分，RSD 為0.161%，表明該工藝穩定可行、重復性好，可作為三七滅菌工藝。

表5 三七滅菌工藝響應面平行驗證實驗結果

2.7 不同滅菌方式對三七質量的影響

2.7.1微生物限度對比 按 《中國藥典》2020 年版（四部）通則 1108 中藥飲片微生物限度檢查法進行實驗，結果顯示，需氧菌、霉菌和酵母菌總數均小于10 CFU·g-1，大腸埃希氏菌和活螨未檢出，各滅菌樣品均達到預期滅菌效果。

2.7.2《中國藥典》2020年版各自檢查結果對比 按《中國藥典》2020年版（一部）三七項下各項檢查要求，對滅菌前后三七鑒別項、水分、總灰分、酸不溶灰分、浸出物、含量測定進行檢測，結果見表6。濕熱滅菌后，三七中皂苷的含量降低，總質量分數＜5.0%，已不符合《中國藥典》2020年版標準。干熱滅菌后，三七中皂苷的含量也出現一定程度的減少，乙醇滅菌與輻照滅菌對含量影響較小。除含量測定外，其余各項檢測結果均符合《中國藥典》2020 年版規定。

表6 三七不同滅菌方法樣品的《中國藥典》2020年版檢測結果

2.7.3指紋圖譜對比 精密稱取上述各樣品0.6 g，加入甲醇50 mL，放置過夜，置80 ℃水浴提取2 h，放冷，取續濾液，0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脫（0～15 min，21%B；15～20 min，21%～22%B；20～28 min，22%～32%B；28～42 min，32%～38%B；42～65 min，38%～85%B；65～75 min，85%～100%B）；檢測波長203 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL，結果見圖11，相似度結果見表7。乙醇滅菌、輻照滅菌和干熱滅菌指紋圖譜與未滅菌指紋圖譜的相似度均大于0.99，濕熱滅菌指紋圖譜與未滅菌指紋圖譜的相似度均小于0.99。

表7 三七不同滅菌方法樣品的指紋圖譜相似度

圖6 乙醇體積分數和滅菌時間對三七滅菌工藝綜合評分的影響

圖7 乙醇體積分數和干燥溫度對三七滅菌工藝綜合評分的影響

圖8 乙醇用量和滅菌時間對三七滅菌工藝綜合評分的影響

圖9 乙醇用量和干燥溫度對三七滅菌工藝綜合評分的影響

圖10 滅菌時間和干燥溫度對三七滅菌工藝綜合評分的影響

圖11 三七不同滅菌方法樣品的指紋圖譜

3 討論

中藥直接打粉入藥的滅菌一直是中成藥生產過程中不可或缺的一個環節。由于中藥的生長、采收和制備的特殊性，大多數的中藥原料藥都不同程度地帶有一些細菌、霉菌或其他致病菌[11]。目前常規滅菌方法有濕熱滅菌、干熱滅菌、輻照滅菌、乙醇滅菌、微波滅菌、紫外滅菌等，選用適當的滅菌方法，保證滅菌后的中藥生藥粉內在質量的同時，又能滿足微生物限度的要求[2]。因此，本研究通過對比4 種不同滅菌方法，對滅菌前后樣品進行檢測，結果顯示4 種滅菌方法鑒別、水分、總灰分、酸不溶灰分、浸出物和微生物限度均符合《中國藥典》2020 年版規定，但是濕熱滅菌后三七中皂苷含量顯著下降，已低于《中國藥典》2020 年版標準，且與生藥材相比指紋圖譜相似度最低，說明三七不適合濕熱滅菌，這與王影等[12]的研究結果一致。干熱滅菌同樣也會引起皂苷含量的降低。乙醇滅菌與輻照滅菌對皂苷成分影響較小，與生藥材相比指紋圖譜相似度較高，但是輻照滅菌存在殘留問題且生產成本較高，而乙醇滅菌法在較短時間內就能把微生物殺滅，且對三七質量沒有影響，具有滅菌效果可靠、工藝設備簡單、操作方便、生產成本較低等優勢，在實際大生產中是一種常用、經濟的滅菌手段，可以作為三七生藥粉的滅菌方法。

本研究在單因素的基礎上，采用響應面法優化三七乙醇滅菌工藝。結果顯示，最佳滅菌工藝為乙醇體積分數74%、乙醇用量26%、滅菌時間2.2 h、干燥溫度75 ℃，在此滅菌條件下綜合評分為36.19分。在此條件下不僅提高了滅菌率，也更大程度保證了三七皂苷類成分不被破壞，保證了滅菌后三七的質量，為三七直接打粉入藥的滅菌工藝應用奠定實驗基礎，可為三七后續制劑的開發利用提供參考。