一種應用比率熒光法定量分析水體中亞甲基藍含量的方法

李 蘭，張棵實，白文鳳，劉乃青，金 麗*，張建坡*

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022；2.吉化北方龍山助劑有限公司，吉林 吉林 132022；3.吉林石化公司研究院，吉林 吉林 132022)

亞甲基藍是一種常見的吩噻類染料，又名美藍、品藍等，廣泛應用于化學、生物實驗室染色劑和醫療藥物等領域.但過量使用亞甲基藍會導致人體出現亨氏小體貧血、紅細胞形態改變以及壞死膿腫等癥狀.雖然對不同動物的毒性略有差異，但是當亞甲基藍濃度過量時，會導致動物的死亡[1].美國、歐盟、日本等已相繼限制亞甲基藍的濫用并制訂了亞甲基藍殘留量的檢測標準，日本規定最大殘留限量為10 μg·kg-1，歐盟規定其用于消毒使用的終濃度不能超過0.4 mg·kg-1[2]，因此檢測水中的亞甲基藍殘留對環境監測、生態環境保護、綠色養殖具有重要意義[3].目前亞甲基藍的檢測方法主要有表面增強拉曼法(SERS)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5-6]、免疫法[7]、電化學法[8]、比色法[9]、超高效液相色譜-串聯質譜聯用法[10-11]、分光光度法[12-13].但存在需要復雜的前處理過程、儀器昂貴、檢測時間長、靈敏度低等問題，因而需要探索更為便捷、快速、靈敏度高的檢測方法.

比率熒光體系[14]采用雙發射的強度比作為檢測信號，可以提供針對外部干擾的內置校正，并消除儀器引起的負面影響，顯著提高方法的靈敏度.與單波長信號的傳統熒光分析相比[15]，比率熒光探針具有靈敏度高、穩定性好等優點.基于石墨烯量子點的比率型熒光探針作為比率型熒光體系的后起之秀，其具備了熒光納米探針的高光學穩定性與熒光效率,并結合了比率熒光探針的優點，在定量和可視化分析中得到了廣泛的應用.

以石墨烯量子點與CdTe量子點混合溶液建立比率熒光檢測體系(簡稱CG體系)，討論了亞甲基藍與該CG體系的相互作用，并基于亞甲基藍濃度與CG體系熒光強度的變化呈正比例關系，建立了一種可用于亞甲基藍定量分析的檢測方法.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

亞甲基藍購自天津市河東區紅巖試劑廠，其他所有試劑均為分析純，使用前未做任何處理.水為雙蒸水(>18 MΩ·cm).

1.2 儀器與設備

F-280熒光分光光度計(天津港東)；紫外分光光度計UV-2550(日本島津)；pHS-3C型數字酸度計(上海儀電科學儀器股份有限公司).

1.3 實驗方法

如文獻所述的方法[16]制備了石墨烯量子點和CdTe量子點，并構建CG體系.將30 μL石墨烯量子點與50 μL的CdTe量子點混合，定容到2 mL(pH=8)，測得熒光發射光譜，激發波長380 nm，激發狹縫為5.0 nm，發射狹縫為10.0 nm.向上述構建CG體系中，加入一定量亞甲基藍溶液，調節pH，孵育2 min后，在上述相同條件下測得熒光發射光譜.

2 結果與分析

2.1 CG體系檢測條件的優化

為了得到可靠的分析結果，首先討論了pH和溫度對該亞甲基藍-CG體系的影響.pH會引起體系中CdTe量子點熒光強度的較大波動，這是由于氫離子會引起CdTe量子點表面的巰基丙酸性質改變，導致CdTe量子點熒光強度降低.但是氫離子對石墨烯量子點熒光強度的影響較小，如圖1(a)所示，綜合考慮，選擇pH為8作為反應條件.此外，研究了向CG體系中加入亞甲基藍后(加入0.1 g·L-1的亞甲基藍溶液20 μL)，孵育時間對熒光強度的影響，如圖1(b)所示，可見CG體系的熒光強度變化較小，為了得到可信的分析結果，選定孵育時間為2 min.

t/min(a)

pH(b)圖1 pH對CG體系的熒光強度影響關系圖和孵育時間對CG體系的熒光強度影響關系圖

2.2 亞甲基藍-CG體系的建立

將一系列0.1 g·L-1的亞甲基藍加入CG體系中，CdTe量子點的熒光發射強度隨著亞甲基藍濃度的增加而逐漸降低，而且CdTe量子點的最大熒光發射波長也隨之發生明顯的藍移，但是石墨烯量子點的熒光發射強度和最大熒光發射波長幾乎未發生變化，如圖2(a)所示.

Wavelength/nm(a)

Concentrations of Methylene blue/(μmol·L-1)(b)圖2 加入亞甲基藍后CG體系的熒光光譜圖和相應的線性關系圖

此外，亞甲基藍的濃度與CG體系熒光強度的比值F487 nm/F640 nm之間具有良好的線性關系，如圖2(b)所示，回歸方程為F487 nm/F640 nm=0.038 64[亞甲基藍]+0.9459，R2=0.999 5，根據文獻[17]計算可得最低檢出限為0.2182 μmol·L-1.通過進一步研究(如圖3所示)，測定該猝滅體系的最低檢出限為0.558 9 nmol·L-1，線性范圍為3.13～9.38 nmol·L-1，激發狹縫為5 nm，發射狹縫為10 nm.

Concentrations of Methylene blue/(nmol·L-1)圖3 亞甲基藍濃度與CG體系熒光強度變化(F487 nm/F640 nm)的關系圖

2.3 亞甲基藍與CG體系作用機理探討

由圖2可知，將亞甲基藍加入CG體系中，CdTe量子點的熒光強度會發生明顯的降低，但是石墨烯量子點的熒光強度變化不大，這是建立本比率熒光法定量分析亞甲基藍的前提條件.為了進一步研究該體系的檢測機理，研究了孵育溫度為20 ℃和30 ℃時，不同濃度亞甲基藍對CdTe量子點熒光強度的影響，如圖4所示.

Concentrations of Methylene blue/(mg·L-1)圖4 不同孵育溫度對亞甲基藍-CdTe量子點體系熒光強度影響關系圖

隨著亞甲基藍濃度的增加，CdTe量子點熒光強度逐漸降低，且熒光強度的變化與亞甲基藍的濃度之間具有較好的線性關系，隨著溫度升高，回歸線的斜率變小了.由此可推斷亞甲基藍所引起CdTe量子點熒光強度的降低為靜態猝滅過程，即亞甲基藍與CdTe量子點之間形成了復合物，隨著溫度的升高，復合物穩定性降低，猝滅效率降低，即斜率減小.為了進一步證明以上推斷，測定了CdTe量子點溶液中加入亞甲基藍前后的紫外可見吸收光譜，如圖5所示.結果表明，加入亞甲基藍溶液后，CdTe量子點的最大吸收波長發生了明顯的變化，說明有新的復合物生成，即亞甲基藍和CdTe量子點之間生成了復合物.

Wavelength/nm圖5 亞甲基藍加入CdTe量子點溶液前后的紫外可見吸收光譜圖

此外，根據許金鉤提出的熒光猝滅可分為靜態猝滅過程和動態猝滅過程，均符合公式F0/F= 1 + Kqτ0M= 1 + KsvM，其中τ0代表量子點的平均熒光壽命，M代表亞甲基藍的濃度，Kq代表熒光衰減常數，Ksv代表回歸線的斜率.測得熒光衰減曲線后(譜圖未給出)，通過平均加權計算法得到了CdTe量子點的平均熒光壽命為20 ns[18].通過公式Kq=Ksv/τ0可得20 ℃和30 ℃時的Kq分別為2.121×1012和1.192×1012，均大于最大靜態猝滅常數(2×1010mol·L-1·s-1)，說明為靜態猝滅過程.綜上所述，通過變溫實驗、紫外可見吸收光譜和計算均證明，亞甲基藍與CdTe之間生成了復合物，引起CdTe量子點熒光靜態猝滅.

2.4 實際樣品分析

通過測定一些金屬離子對該比率熒光體系熒光強度的影響，考察了該方法的選擇性.研究發現水中常見的鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、氯離子、硫酸根離子均不會對體系熒光產生明顯的影響，即熒光強度不會增大或減小.雖然三價/二價鐵離子、銅離子、錳離子會同時引起量子點熒光強度的增大或減小，但是熒光強度比不會發生明顯的變化，這說明該比率熒光法用于亞甲基藍的檢測具有較好的選擇性.

將該熒光體系用于實際樣品的分析，水樣為模擬廢水，即向去離子水中加入確定量的亞甲基藍溶液得到樣品，分析結果如表1所示.回收率為97.60%-101.3%，說明本方法可以用于樣品中亞甲基藍的定量分析.

表1 水樣中亞甲基藍含量分析

3 結 論

成功地采用石墨烯量子點和CdTe量子點建立了一種比率熒光檢測方法，可用于水體中亞甲基藍的定量分析，最低檢出限為0.558 9 nmol·L-1.并采用變溫實驗、紫外可見吸收和計算對亞甲基藍和CdTe量子點之間的相互作用機理進行了討論，證明亞甲基藍所引起的CdTe量子點熒光強度的降低為靜態猝滅過程.研究表明，該比率熒光法用于亞甲基藍的定量分析具有較好的靈敏度和選擇性，可用于實際水樣中亞甲基藍含量的分析.